La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria
Summary
Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.
Abstract
El desarrollo y mantenimiento de las células CD4 + inmunosupresores células T reguladoras (Tregs) contribuir a la tolerancia periférica necesaria para permanecer en homeostasis inmunológica con la gran cantidad de antígenos propios y comensales en y sobre el cuerpo humano. Las perturbaciones en el equilibrio entre las células T reguladoras y células T inflamatorias convencionales puede resultar en la inmunopatología o el cáncer. Aunque la inyección terapéutica de Tregs ha demostrado ser eficaz en modelos murinos de la colitis 1, diabetes tipo I 2, la artritis reumatoide y enfermedad de injerto contra huésped, 4 varias diferencias fundamentales en humanos versus ratón TREG biología 5 hasta ahora ha impedido el uso clínico. La falta de número suficiente, la pureza, la estabilidad y la especificidad de recalada terapéutico Tregs necesaria una plataforma dinámica de desarrollo TREG humana en la que para optimizar las condiciones para su expansión ex vivo 6.
Aquí Describe un método para la diferenciación de las células T reguladoras inducidas (iTregs) a partir de un solo donante de sangre periférica humana que se puede dividir en cuatro etapas: el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica, la selección magnética de células T CD4 +, en el cultivo celular in vitro y activadas por fluorescencia clasificación de células (FACS) de subconjuntos de células T. Puesto que la transcripción TREG firma factor de forkhead P3 caja (FoxP3) es un factor de transcripción inducida por activación en los seres humanos 7 y ningún otro marcador único existe, un panel de combinatoria de marcadores debe ser utilizado para identificar las células T con actividad supresora. Después de seis días de cultivo, las células de nuestro sistema pueden ser demarcadas en las células T ingenuas, las células T de memoria o iTregs en función de su expresión relativa de CD25 y CD45RA. Mientras que las células T ingenuas de memoria y tienen diferentes informes sobre las necesidades de polarización y plasticidades 8, pre-clasificación de la población de células T inicial en CD45RA + y CD45RO + subconjuntos puede be utiliza para examinar estas discrepancias. De acuerdo con los demás, nuestra CD25 Hola CD45RA – iTregs expresar altos niveles de FoxP3 9, GITR y CTLA 4-11 y bajos niveles de CD127 12. Tras FACS de cada población, las células resultantes pueden ser utilizados en un ensayo supresor que evalúa la capacidad relativa para retardar la proliferación de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE)-etiquetados células T autólogas.
Protocol
Discussion
Si bien la transferencia TREG es una gran promesa terapéutica para combatir el rechazo del injerto autoinmunidad y otros trastornos inmunes o inflamatorias mediadas, métodos para su generación eficiente y el mantenimiento estable todavía no se han desarrollado. Dado que sólo el 1-5% de la circulación de las células T son células T reguladoras, su expansión controlada y la diferenciación supera esta escasez como un importante elemento de disuasión de la aplicación de células T reguladoras en la clínica. Por…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Lymphoprep | Axis-Shield | 1114547 | Keep at room temperature |
| Refrigerated Bench-Top Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Bright-Line Hemocytometer | Hausser Scientific | 3110 | |
| EasySep Human CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19052 | |
| EasySep Human Memory CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19157 | |
| EasySep Human Naïve CD4+ T Cell Enrichment Kit | Stem Cell Technologies | 19155 | |
| The Big Easy EasySep Magnet | Stem Cell Technologies | 18001 | Silver |
| 5 mL Round Bottom Polystyrene Tubes | BD Falcon | 352008 | |
| 15 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-368 | |
| 14 mL Polypropylene Round-Bottom Tubes | BD Falcon | 352059 | |
| 50 mL Polypropylene Centrifuge Tubes | VWR | 89004-364 | |
| Human anti-CD3 Antibody | Bio X Cell | BE0001-2 | Clone: OKT3 |
| 24 Well Cell Polystyrene Culture Plate | BD Falcon | 353047 | |
| 96 Well Round Bottom Tissue Culture Plate | Grenier Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 with Glutamax-I and HEPES Buffer | Gibco | 72400 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 16000 | |
| β-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Recombinant Human TGF-β1 | eBioscience | 14-8348-62 | |
| Recombinant Human IL-2 | eBioscience | 14-8029-63 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MP Biomedicals Inc. | 810531 | |
| 0.5 M EDTA | Amresco | E177 | |
| Mouse Anti-Human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | Clone: 4E3 |
| Mouse Anti-Human CD45RA-PE-Cy5 | eBioscience | 15-0458-42 | Clone: HI100 |
| Mouse Anti-Human CD127-APC | Miltenyi Biotec | 130-094-890 | Clone: MB15-18C9 |
| DNase II | MP Biomedicals Inc. | 190370 | |
| MoFlo Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | Tree Star, Inc. | ||
| Cell Quest Pro Software | BD Biosciences | ||
| Newborn Calf Serum | Gibco | 16010 | |
| L-glutamine | Gibco | 25030 | |
| AIM-V | Gibco | 0870112 | |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Invitrogen | C34554 | |
| Treg Suppression Inspector Beads | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| 40 μM Nylon Cell Strainer | BD Falcon | 352340 |
References
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