הדמיה כמותי של שושלת ספציפית חיוג כמו קולטן בתיווך איתות מונוציטים ותאים דנדריטים של דגימות קטנות של דם אנושי

Summary

אנו מתארים שימוש בטכנולוגיה ImageStream (<a href="http://www.amnis.com/" target="_blank"> Www.amnis.com</a>), המשלבת cytometry זרימת כמותית עם סימולטני ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית, לכמת המנגנונים התאיים של תאים חיסוניים ראשוניים של קבוצות מוגדרות היטב המטופל. המחקרים שלנו לספק תכנית לחקירות של תרגום לכמת ספציפיים השושלת התגובות הסלולר בדגימות קטנות מקבוצות הנושא.

Abstract

וריאציות אישיות במעמד החיסון לקבוע התגובות זיהום ולתרום חומרת המחלה ואת התוצאה. הזדקנות קשורה לרגישות מוגברת לזיהומים ויראליים וחיידקים וירידה ההיענות לחיסונים עם ירידה מתועד היטב על הלחות כמו גם התא בתיווך החיסונית ^1,2 התגובות. יש לנו העריכו לאחרונה את השפעות ההזדקנות על חיוג כמו קולטנים (TLRs), רכיבים מרכזיים של מערכת החיסון המולדת, כי לזהות זיהום מיקרוביאלי ו מיקרוביאלית טריגר מארח הגנה התגובות ^3. בכל קבוצה גדולה של תורמים אנושיים בריאים, הראינו כי מונוציטים בדם הפריפרי של הקשישים ירדו ביטוי ותפקוד של TLRs מסוימים דומים רמות ⁴ ו TLR מופחת ותגובות איתות תאים דנדריטים (DCS), אנטיגן, הצגת תאים שהם מרכזי הקשר בין חסינות מולד אדפטיבית ^5. הראינו dysregulation של TLR3 ב מקרופאגיםד ייצור נמוך של אינטרפרון על ידי DCS מתורמים קשישים בתגובה לזיהום עם וירוס הנילוס המערבי ^6,7.

Paramount להבנת immunosenescence כדי התערבות טיפולית היא הבנה מפורטת של סוגי תאים מסוימים להגיב מנגנון (ים) של התמרה האות. מחקרים המסורתיים של התגובה החיסונית באמצעות הדמיה של תאים ראשוניים סמנים תא מדידות על ידי FACS או immunoblot קידמו את ההבנה שלנו באופן משמעותי, לעומת זאת, מחקרים אלה מוגבלים בדרך כלל טכנית, על פי היקף המדגם הקטן זמינים חולים וחוסר יכולת לבצע טכניקות מעבדה מורכבות על מספר רב של אדם דגימות. ImageStream משלב cytometry זרימת כמותית עם סימולטני ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית, ובכך מקלה על החקירה אוכלוסיות תאים מרובים ההתרחשויות ללכוד יעיל של רגישות החולה. כאן אנו מדגימים את השימוש ImageStream ב DCS להעריך TLR7 / 8הפעלת בתיווך עליות זירחון ו טרנסלוקציה הגרעין של גורם שעתוק מפתח, NF-κB, אשר יוזם שעתוק של גנים רבים הם קריטיים עבור המערכת החיסונית ^8. באמצעות טכנולוגיה זו, יש לנו גם הפגינו לאחרונה שינוי מוכרים קודם לכן של TLR5 איתות מסלול NF-κB ב מונוציטים מתורמים מבוגרים שעשוי לתרום התגובה החיסונית להשתנות ההזדקנות ^9.

Protocol

1. בידוד וגירוי של תאים חיסוניים להשיג 10-50 מ"ל דם heparinized ממתנדבים בריאים לאחר הסכמה מדעת בכתב לפי הנחיות הדירקטוריון סקירה מקומית המוסדי. ללימודים של הזדקנות או מחלות, הפתוגנזה הדרה קריטריוני ההכללה של כל מתנדב או המ…

Discussion

השלבים הקריטיים השימוש ImageStream ללימודים של תרגום הם הבחירה של קבוצות השוואה רלוונטיות אופטימיזציה ואימות של סגוליות נוגדנים. הבדלים בין קבוצות נושא היעד שכותרתו תהיה ברורה ממבט ראשון באמצעות היסטוגרמות ותמונות סלולריים. בשילוב עם ניתוח מעמיק של שינויים הקולטנים רל?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
R848	Invivogen	tlrl-r848
Paraformaldehyde (16%)	Electron Microscopy Sciences	15710
BD Perm/Wash	BD Biosciences	554723
CD14-PE	eBioscience	12-0149-41
CD4-PacBlue	BD Pharmingen	68436
Lineage cocktail 1 (lin 1)-FITC	BD Biosciences	340546
CD11c-PE	BD Biosciences	347637
CD123-PE	BD Biosciences	340545
rabbit anti-NF-κB (p65)	SantaCruz	SC-372
Alexa647 F(ab’)2 goat anti-rabbit IgG	Invitrogen	A21246
DAPI	Invitrogen	D21490
ImageStream X	Amnis

Table 1. Specific reagents and equipment.

Cell type	FITC	PE	Alexa 647	PacBlue
Monocyte		CD14	NF-κB (p65)
mDC	Lin1	CD11c	NF-κB (p65)	CD4
pDC	Lin1	CD123	NF-κB (p65)	CD4

Table 2. Antibody panel for cell lineage staining of signaling pathways

Monocyte: CD14+
mDC: Lin1-, CD4dim, CD11c+
pDC: Lin1-, CD4dim, CD123+
Lin1 (lineage) marker includes CD3, CD14, CD19, CD20, CD56 markers for monocytes, NK cells, T & B cells.