Laterale diffusie en Exocytose van membraaneiwitten in gekweekte zenuwcellen gemeten met behulp van Fluorescence Recovery en fluorescentie-verlies fotobleken

Summary

Dit rapport beschrijft het gebruik van live cell imaging en photobleach technieken om de oppervlakte-expressie, transportroutes en handel in kinetiek van exogeen uitgedrukt, pH-gevoelige GFP-gelabelde eiwitten in de plasmamembraan van neuronen te bepalen.

Abstract

<p class="jove_content"> Membraan eiwitten zoals receptoren en ionkanalen ondergaan actieve handel in neuronen, die sterk gepolariseerd en morfologisch complex. Deze gerichte mensenhandel is van fundamenteel belang te leveren, te onderhouden of te verwijderen synaptische eiwitten.</p><p class="jove_content"> Super-ecliptica pHluorin (SEP) is een pH-gevoelige derivaat van EGFP dat op grote schaal gebruikt voor beeldvorming van levende cellen van plasmamembraaneiwitten^1-2. Bij een lage pH, protonering van SEP vermindert foton absorptie en elimineert fluorescentie-emissie. Aangezien de meeste intracellulaire gebeurtenissen in de handel compartimenten lage pH, waar september fluorescentie verduisterd het fluorescentiesignaal van SEP-gemerkte eiwitten overwegend van de plasmamembraan waar SEP wordt blootgesteld aan een neutrale pH extracellulaire omgeving. Als deze brandt, bij hoge intensiteit SEP, zoals elke fluorescerende kleurstof, is onomkeerbaar photodamaged (photobleached)^3-5. Belangrijk, want een lage pH-foton absorptie lest, alleen aan de oppervlakte uitgedrukt SEP kan worden photobleached dat de intracellulaire SEP is niet beïnvloed door de hoge intensiteit verlichting^6-10.</p><p class="jove_content"> FRAP (Fluorescence Recovery After fotobleken) van SEP-gemerkte eiwitten is een handige en krachtige techniek voor de beoordeling van eiwit dynamiek op de plasmamembraan. Bij het fluorescent gemerkte eiwitten zijn photobleached in een regio van belang (ROI) het herstel van de fluorescentie optreedt als gevolg van de beweging van ongebleekte SEP-gemerkte eiwitten in het gebleekte gebied. Dit kan gebeuren door laterale diffusie en / of exocytose van niet-photobleached receptoren hetzij door<em> De novo</em> Synthese of recycling (zie Fig. 1). De fractie van immobiele en mobiele eiwit kan worden bepaald en de mobiliteit en de kinetiek van de diffundeerbare fractie kan worden verhoord onder basale als de gestimuleerde aandoeningen zoals agonist toepassing of neuronale activatie stimuli zoals NMDA of KCl toepassing^8,10.</p><p class="jove_content"> We beschrijven photobleaching technieken ontworpen om selectief te visualiseren het herstel van de fluorescentie toe te schrijven aan exocytose. In het kort wordt een ROI keer photobleached als met standaard FRAP protocollen, volgde, na een korte herstel, door repetitieve bleken van de flankerende gebieden. Deze 'FRAP-FLIP' protocol, ontwikkeld in ons lab, is gebruikt om AMPA receptor mensenhandel te kwalificeren dendritische spines¹⁰ En is van toepassing op een breed scala van mensenhandel studies om de intracellulaire mensenhandel en exocytose te evalueren.</p>

Protocol

1. Cultuur van de Cel, virale transductie, en eiwitexpressie Cultuur met een hoge dichtheid hippocampale neuronen uit embryonale dag 18 (E18) jonge ratten op poly-L-lysine-gecoate dekglaasjes voor 14-25 dagen in vitro (DIV). 6-24 uur voorafgaand aan de live-experimenten, transduceren cellen met een verzwakte Sindbis virus met het membraan eiwit van belang, gelabeld met de super-ecliptica pHluorin (SEP). Direct Voeg de pseudovirion-bevattende medium om de dekglaasje met 1 ml van de geconditioneerde media en keerde terug naar de cultuur incubator. De titer en tijd na virale eiwitexpressie transductie afhankelijk van de virusbatch en worden voor elke partij alvorens aan levende cellen experimenten. 2. FRAP-FLIP live cell imaging Apparatuur set-up Breng het dekglaasje aan de beeldvorming kamer van een Zeiss Axiovert LSM 510 META confocale microscoop.Om schommelingen in de spanning te minimaliseren tijdens de beeldvorming, zorgen voor de microscoop is ingeschakeld, met 100% laser output, gedurende tenminste 20 minuten voorafgaand aan de beeldvorming. Onmiddellijk vervangen kweekmedium met voorverwarmd (37 ° C) extracellulaire oplossing die 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM glucose, 1,5 mM CaCl2, 1,5 mM MgCl2, 20-25 mM HEPES (pH ingesteld op 7,4 met NaOH) en plaats de kamer op de voorverwarmde fase (37 ° C) van de Zeiss Axiovert. Zorgen de osmolariteit van het extracellulaire oplossing wordt tot binnen 10 mOsm van kweekmedium. Mits geen significante verdamping plaatsvindt tijdens het tijdsverloop van het experiment CO 2 onafhankelijke oplossing geschikt is voor korte experimenten (<10 uur). aan te vullen met 1-2 mm natrium-bicarbonaat wordt aanbevolen. het definiëren van de beeldvorming capture parameters eerst identificeren een neuron expressie recombinante proeiwit interesse en breng in beeld. 63x olie bezwaar, krijgen beeld hele cel behulp 488nm laserlicht excitatie bij lage laservermogen. minimaliseren fotobleken, gebruik maken snelle nominale snelheid (7-9) pixel resolutie (512-512) bijhouden totale scan <1 seconde. selecteer deel dendriet om zoom op frame daarin roi (~ 1.5-2.5 x optische zoom) vast leggen. indien mogelijk voor gezichtsveld bevat verschillende processen is dat metingen uit referentie dendrieten kunnen worden verkregen, bepalen of niet-specifieke photobleaching door verwerving optreedt. pas filters, pinhole-, scan-snelheid detector winst maximale fluorescentie staat stellen minimale laser excitatie, maar beperkte verzadiging. grote pinhole diameter aanbevolen foton collectie maximaliseren (2 pm geschikt stekels ternaire dendrieten). moet sterk genoeg zijn kleine stappen sporen,zodanig eerste beelden fotobleken niet meer dan 10% verzadigde pixels overwinnen. sla deze configuratie gebruikt pre-> Figuur 1. Schematische voorstelling van de principes van FRAP vs FRAP-FLIP protocollen Dit schema illustreert de resultaten van een regelmatige FRAP versus protocol een 'FRAP-FLIP', met behulp van SEP-gelabeld receptoren. Fluorescentieherstel in traditionele FRAP wordt op links. Gemeten fluorescentieherstel in de centrale ROI wordt toegeschreven aan een combinatie van laterale diffusie f niet photobleached SEP-gelabeld receptoren buiten photobleached ROI en insertie van receptoren door recycling en / of de novo exocytose de dendritische as. Daarentegen, de repetitieve photobleached van de flankerende ROI geïllustreerd in uw rechterhand, laat zien hoe dit gewijzigde 'FRAP-FLIP' protocol stiltes herstel als gevolg van laterale diffusie. Als zodanig kan iedere gemeten fluorescentieherstel worden toegeschreven aan directe insertie in de ROI. Figuur 2.Het inbrengen van SEP-GluA2 in de plasmamembraan van de dendritische as A) Een hippocampal neuron uiten SEP-GluA2, selectief photobleached langs een regio van dendriet. Het schema illustreert de regio van dendriet die is afgebeeld, terwijl de bovenste linker paneel wijst op de ROI die zijn geselecteerd voor fotobleken. De grote witte doos gebied was ooit gebleekt, gevolgd door herhaalde bleken van de flankerende omkaderde gebieden, gemarkeerd met dubbele geleide blauwe pijlen. Dit paneel toont de dendriet voorafgaand aan fotobleken. De rode pijl geeft de gemeten ROI, te zien in een hoge vergrotingsfactor in de onderste panelen. B) toont de fluorescentie-intensiteit in de gemeten ROI gedurende het tijdsverloop van het experiment, uitgezet grijsniveau de ROI (niet genormaliseerd). De zwarte pijl markeert de meetpunt van de eerste photobleach en groene pijl duidt de start van de herhalende fotobleken. AF geeft aan ee toename van de fluorescentie waargenomen gedurende de herstelperiode, als gevolg van het inbrengen van SEP-GluA2 in de dendritische as. Na een lage pH en pH 7,4 + NH 4 Cl wasbeurten bevestigen dat de herstelde fluorescentie heeft betrekking op de oppervlakte uitgedrukt receptoren. Figuur 3. Recycling en laterale diffusie vs Recycling van SEP-GluK2 op de dendritische as na cyclohexamide behandeling A) Een hippocampal neuron uiten SEP-GluK2, selectief photobleached met parallelle FRAP en 'FRAP-FLIP' nuttige toepassing protocollen uitgevoerd langs verschillende dendritische ROI. Dit neuron werd onderworpen aan een voorbehandeling met cyclohexamide te eiwitsynthese (2 uur bij 200 pg / ml) blokkeert. Het schema illustreert de regio van dendriet die is afgebeeld, terwijl het linkerpaneel wijzen op de ROI die zijn geselecteerd voor fotobleken. The grote witte doos gebied was ooit gebleekt, gevolgd door herhaalde bleken van de flankerende omkaderde gebieden, van de lagere dendriet alleen gemarkeerd met een dubbele leiding blauwe pijlen. Dit paneel toont de dendrieten voorafgaand aan fotobleken. Rode pijlen wijzen op de ROI getoond in een sterke vergroting in B) ter illustratie van de fluorescentie herstel van de traditionele FRAP versus protocol de 'FRAP-FLIP'. Vergelijking van niveaus van fluorescentie-intensiteit in de late fase van herstel (derde panelen) tonen de bijdrage van laterale diffusie en recycling versus recycling alleen. C) toont de fluorescentie-intensiteit in de gemeten ROI gedurende het tijdsverloop van het experiment, uitgezet genormaliseerde intensiteit waarden. De zwarte pijl markeert de meetpunt van de eerste photobleach en groene pijl duidt de start van de herhalende fotobleken. AF rec geeft aan dat het van voorbijgaande aard herstel als gevolg van receptor recycling, bepaald door de FRAP / FLIP dendriet, terwijl AFdiff meet de bijdrage van laterale diffusie van SEP-GluK2 in de dendritische as in de 'FRAP slechts' ROI. De tijdelijke verhoging wordt gevolgd door geleidelijke daling signaal overeenkomt met de afdaling beschikbare receptoren als gevolg van cyclohexamide behandeling. De daaropvolgende lage pH en pH 7,4 + NH 4 Cl wasbeurten bevestigen dat de herstelde fluorescentie heeft betrekking op de oppervlakte uitgedrukt receptoren.

Discussion

We beschrijven een innovatieve strategie om de componenten van plasma membraaneiwit handel te visualiseren. De combinatoriële benadering van fotobleken technieken met SEP-gemerkte eiwit maakt selectief plasmamembraan inbrengen gebeurtenissen worden beoordeeld. Door voortdurend fotobleken het membraan eiwitten in flankerende gebieden tijdens het herstel, de 'FRAP-FLIP-methode beoordeelt de bijdrage van vesiculair transport naar fluorescentie herstel. Deze nieuwe aanpak maakt het mogelijk direct de opname van eiwit membraan inbrengen, waardoor zowel het aantal sub-compartimenten waarin het herstel wordt waargenomen en de amplitude van het herstel (AF) op de steady-state te bepalen. Verder vergelijking FRAP met en zonder FLIP kan het percentage herstel toe te schrijven aan laterale diffusie worden berekend.

Bovendien hetzelfde experiment kan gebieden niet photobleached dendrieten naast de flankerende regio's photobleachedkwalitatief beoordeeld tijdens het herstel; fluorescentie verlies waargenomen in deze regio's zal als gevolg van laterale diffusie van photobleached receptoren in deze niet-photobleached segmenten van de dendriet.

Deze selectieve fotobleken protocol kan worden gebruikt om verschillende cellulaire transport processen zoals kenmerkend excocytosis de plasmamembraan in bepaalde deelgebieden (bijvoorbeeld dendrieten of ruggen) of waarin de bijdrage van laterale diffusie vs aanbrengen door een parallel FRAP en "FRAP onderzoeken -Flip 'protocollen langs aangrenzende dendrieten (afb. 3).

Het is duidelijk dat, terwijl de specifieke richtlijnen zijn gepresenteerd, zal elk lab nodig optimaliseren van de beeldvorming parameters volgens specifieke monsters en apparatuur. Belangrijk alle oppervlakte receptoren in de ROI moeten photobleached, onafhankelijk van de z-as brandvlak zonder aanzienlijke beschadiging fototoxische of niet-specifieke fotobleken. Onsers dienen voorzichtigheid te betrachten bij een poging dit protocol in de cel soma, zoals het hoge percentage van relatief lage pH intracellulaire compartimenten meestal resulteert in een hoge achtergrond fluorescentie in deze regio's. En hoewel we hebben aangetoond hoe deze techniek kan worden toegepast op verschillende manieren, alvorens aan selectieve fotobleken experimenten op nieuwe SEP-gelabelde construeren raden dat een eerste karakterisering van de gemerkte receptor eerst uitgevoerd zoals beschreven door Ashby et al. ^2.

Over het geheel genomen is deze methode een krachtige en veelzijdige aanpassing van de standaard FRAP-protocol, waardoor het inbrengen gebeurtenissen in plasmamembraan te worden geëvalueerd in de buurt van real-time.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
24mm glass coverslips	VWR International	631-0161
Poly-l-lysine	Sigma	P2636	1mg/ml in borate buffer to coat coverslips
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% in neuronal plating and feeding medium
Penicillin Streptomycin	Sigma	P0781	1% in neuronal plating and feeding medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM in plating/feeding medium
Horse Serum	Biosera	DH-291H	10% in neuronal plating media only
pSIN ReP5 cloning vector	Invitrogen	K75001	For Sindbis virus production
LSM510 META confocal system	Zeiss
Image J Software	NIH		open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/