Diffusion latérale et l'exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l'aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Summary

Ce rapport décrit l'utilisation de l'imagerie des cellules vivantes et des techniques de photoblanchiment pour déterminer l'expression de surface, les voies de transport et de la cinétique du trafic de manière exogène exprimé, sensible au pH GFP-protéines marquées à la membrane plasmique des neurones.

Abstract

<p class="jove_content"les protéines membranaires> tels que les récepteurs et canaux ioniques subir le trafic actif dans les neurones, qui sont très polarisé et morphologiquement complexe. Ce trafic dirigé est d'une importance fondamentale pour fournir, maintenir ou éliminer les protéines synaptiques.</p><p class="jove_content"> Super-écliptique pHluorin (SEP) est un dérivé sensible au pH de eGFP qui a été largement utilisé pour l'imagerie des cellules vivantes de protéines membranaires^1-2. À faible pH, la protonation de SEP diminue l'absorption de photons et élimine l'émission de fluorescence. Que les événements de trafic les plus intracellulaires se produisent dans des compartiments ayant un faible pH, où la fluorescence est éclipsé septembre, le signal de fluorescence à partir des protéines marquées SEP est principalement de la membrane plasmique, où le PES est exposée à un environnement à pH neutre extracellulaire. Lorsqu'il est allumé à septembre de haute intensité, comme tous les colorant fluorescent, est irréversible photovieillissement (photobleached)^3-5. Il est important, car un faible pH étanche absorption d'un photon, qu'en surface exprimé SEP peut être photobleached tandis septembre intracellulaire n'est pas affectée par l'éclairage de haute intensité^6-10.</p><p class="jove_content"> FRAP (retour de fluorescence après photoblanchiment) de SEP-protéines marquées est une technique pratique et puissant pour évaluer la dynamique des protéines à la membrane plasmique. Lorsque les protéines marquées par fluorescence sont photobleached dans une région d'intérêt (ROI) la récupération de la fluorescence est due à la circulation des écrus protéines SEP-marqués dans la région blanchie. Cela peut se produire par l'intermédiaire d'une diffusion latérale et / ou de l'exocytose des récepteurs non photobleached fourni soit par<em> De novo</emSynthèse> ou le recyclage (voir Fig. 1). La fraction de la protéine immobile et mobile peut être déterminée et la mobilité et de la cinétique de la fraction diffusible peut être interrogé dans les conditions basales et stimulées comme l'application agoniste ou des stimuli d'activation neuronale tels que NMDA ou KCl demande^8,10.</p><p class="jove_content"> Nous décrivons les techniques de photoblanchiment conçus pour visualiser la récupération sélective de la fluorescence due à l'exocytose. En bref, un retour sur investissement est photobleached fois que les protocoles standard du PAF, suivie, après une brève reprise, par répétitif blanchiment des régions adjacentes. Ce protocole «FRAP-FLIP», développée dans notre laboratoire, a été utilisée pour caractériser le trafic des récepteurs AMPA à épines dendritiques¹⁰, Et est applicable à un large éventail d'études de trafic pour évaluer le trafic intracellulaire et l'exocytose.</p>

Protocol

1. Culture cellulaire, transduction virale, et l'expression des protéines Neurones hippocampiques Culture à haute densité de embryonnaires ratons jour 18 (E18) sur des lamelles de verre poly-L-lysine pour 14-25 jours in vitro (DIV). 6-24h avant les expériences en direct, les cellules transduisent avec atténué virus Sindbis contenant la protéine membranaire d'intérêt, étiqueté avec le super-pHluorin écliptique (SEP). Ajouter le milieu contenant pseudovirion directement à la lamelle contenant 1 ml de milieu conditionné et retourné à la culture de l'incubateur. Le titre et l'heure de l'expression des protéines à la suite de transduction virale varie en fonction de la charge virale et doit être déterminée pour chaque lot avant de commencer les expériences de cellules vivantes. 2. FRAP-FLIP imagerie de cellules vivantes Equipement set-up Transférer la lamelle à la chambre de l'imagerie d'un microscope Zeiss Axiovert LSM 510 META confocale.Afin de minimiser les fluctuations de puissance lors de l'imagerie, d'assurer le microscope a été allumé, avec une sortie laser de 100%, pendant au moins 20 minutes avant l'imagerie. Immédiatement, remplacer le milieu de culture avec préchauffé (37 ° C) une solution d'enregistrement extracellulaire contenant 140 mM NaCl, 5 mM de KCl, 15 mM de glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 HEPES (pH ajusté à 7,4 avec NaOH) et placez la chambre sur la scène pré-chauffée (37 ° C) de la Axiovert Zeiss. Assurez-vous de l'osmolarité de la solution d'enregistrement extracellulaire est ajustée à moins de 10 mOsM de votre milieu de culture. Si aucune évaporation notable se produit au cours de la timecourse de l'expérience, ce CO 2 solution indépendante est adapté pour de courtes expériences (<10 heures). compléter avec 1-2 mm de bicarbonate sodium est recommandé. définir les paramètres capture d'imagerie tout d'abord, identifier un neurone exprimant la pro recombinantprotéine d'intérêt et mettre en focus. une huile 63x opposé, acquérir image cellule utilisant l'ensemble 488nm d'excitation lumière laser à faible puissance laser. afin minimiser photoblanchiment, utilisez vitesse rapide nominale (7-9) résolution pixel (512-512) tenue balayage total <1 seconde. sélectionnez partie dendrite l'image le zoom pour capturer contenant roi (~ 1.5 2.5 x optique). lorsque cela possible, assurer champ vision contient plusieurs processus telle sorte que des mesures dendrites référence peut être obtenue, déterminer si non spécifique raison photoblanchiment acquisition se produit. réglez filtres, sténopé, gain du détecteur permettre fluorescence maximale l'excitation minimale, mais saturation limitée. diamètre trou d'épingle grande recommandé, maximiser collecte photons (2 pm convient épines ternaires). doit assez fort déceler petites augmentations fluorescence,de premières images, avant l'photoblanchiment ne pas dépasser 10% pixels saturés. enregistrer cette configuration utilisé pré-> Figure 1. Schéma des principes de FRAP vs FRAP-FLIP protocoles Ce schéma illustre les résultats d'un rapport régulier FRAP protocole un «FRAP-FLIP», en utilisant les tags SEP-récepteurs. Recouvrement de fluorescence dans le FRAP traditionnelle est indiquée sur le côté gauche. Mesuré recouvrement de fluorescence dans le centre ROI est attribuée à une combinaison de diffusion latérales f non-photobleached récepteurs SEP-étiqueté à partir de l'extérieur de la ROI photobleached et l'insertion des récepteurs à travers le recyclage et / ou de novo exocytose dans l'arbre dendritique. En revanche, le photobleached répétitif du ROI d'accompagnement illustré dans droite, montre comment cette mise à jour «FRAP-FLIP« protocole de récupération silences due à la diffusion latérale. En tant que tel, toute récupération de fluorescence mesurée peut être attribuée à une insertion directe dans le retour sur investissement. Figure 2.Insertion de SEP-GluA2 dans la membrane plasmique sur l'arbre dendritique A) Un neurone hippocampique exprimer SEP-GluA2, sélectivement photobleached long d'une région de la dendrite. Le schéma illustre la région de dendrite qui a été imagée, tandis que le panneau supérieur gauche met en évidence le ROI qui ont été sélectionnés pour photoblanchiment. La grande zone blanche en carton a été blanchi une fois, suivi par répétitif blanchiment des régions flanquantes en boîte, mis en évidence avec double tête flèches bleues. Ce panneau montre la dendrite avant photoblanchiment. La flèche rouge indique le retour sur investissement mesuré, montré en fort grossissement dans les panneaux inférieurs. B) montre l'intensité de fluorescence dans le retour sur investissement mesuré au cours du temps de l'expérience, représentée en niveau de gris dans le retour sur investissement (non normalisée). La flèche noire mettre en évidence le point de temps de l'agent de photoblanchiment initiale et flèche verte indique le début de la photoblanchiment répétitif. AF indique èmeaugmentation de la fluorescence e observée au cours de la période de récupération, due à l'insertion de la SEP-GluA2 dans l'arbre dendritique. Après un pH faible et un pH de 7,4 + lavages de NH 4 Cl confirmer que la fluorescence recouvrée se rapporte à la surface des récepteurs exprimés. Figure 3. Recyclage & latérale Recyclage vs diffusion de SEP-GluK2 sur l'arbre dendritique après le traitement cyclohexamide A) Un neurone hippocampique exprimer SEP-GluK2, de manière sélective avec photobleached FRAP parallèle et protocoles de récupération »FRAP-FLIP» effectuées le long ROIs dendritique séparée. Ce neurone a fait l'objet d'un prétraitement avec cyclohexamide, pour bloquer la synthèse des protéines (2 heures à 200 pg / ml). Le schéma illustre la région de dendrite qui a été imagée, tandis que le panneau de gauche mettant en évidence le ROI qui ont été sélectionnés pour photoblanchiment. The grande zone blanche en carton a été blanchie fois, suivie par répétitif de blanchiment des régions flanquant en boîte, de la partie inférieure de dendrites que, mis en évidence avec doubles dirigés flèches bleues. Ce panneau montre les dendrites avant photoblanchiment. Les flèches rouges souligner le ROI indiqué dans un fort grossissement en B) illustrant le recouvrement de fluorescence dans le FRAP traditionnel et le protocole du «FRAP-FLIP». Les comparaisons des niveaux d'intensité de fluorescence dans le stade tardif de la récupération (panneaux tiers) montrent la contribution de la diffusion latérale et le recyclage par rapport recyclage seul. C) montre l'intensité de fluorescence dans le ROI mesuré au cours du temps de l'expérience, représentée en intensité normalisée les valeurs. La flèche noire mettre en évidence le point de temps de l'agent de photoblanchiment initiale et flèche verte indique le début de la photoblanchiment répétitif. AF rec indique la reprise passagère due au recyclage des récepteurs, déterminée à partir de la dendrite FRAP / FLIP tout AFdiff mesure la contribution de la diffusion latérale de la SEP-GluK2 dans l'arbre dendritique dans le «FRAP seulement" retour sur investissement. L'augmentation transitoire est suivie d'un déclin progressif du signal, correspondant à la course vers le bas de récepteurs disponibles à la suite du traitement cyclohexamide. Le pH ultérieure faible et un pH de 7,4 + lavages de NH 4 Cl confirmer que la fluorescence recouvrée se rapporte à la surface des récepteurs exprimés.

Discussion

Nous décrivons une stratégie novatrice de visualiser les composants de la traite plasma protéine de la membrane. L'approche combinatoire de photoblanchiment techniques avec des protéines SEP-étiqueté permet sélectivement les événements plasma membrane d'insertion à être évaluée. En permanence photoblanchiment des protéines membranaires dans des régions adjacentes lors de la récupération, la méthode du «FRAP-FLIP» évalue la contribution du trafic vésiculaire à la récupération de fluorescence. Cette nouvelle approche permet l'enregistrement direct de l'insertion des protéines membranaires, permettant à la fois le nombre de sous-compartiments dont le recouvrement est observé et l'amplitude de la reprise (AF) à l'état stationnaire à déterminer. En outre, la comparaison de PAF avec et sans FLIP permet la proportion de recouvrement attribuable à la diffusion latérale à être calculée.

En outre, dans la même expérience, les régions de non-photobleached dendrite adjacente aux régions flanquantes photobleached peut êtreune évaluation qualitative lors de la reprise, la perte de fluorescence observée dans ces régions sera en raison de la diffusion latérale des récepteurs photobleached dans ces segments non-photobleached de la dendrite.

Ce protocole sélective photoblanchiment peut être utilisée pour étudier une variété de processus cellulaires tels que le trafic caractérisant excocytosis dans la membrane plasmique dans les sous-zones définies (par exemple, les dendrites ou épines) FRAP ou d'évaluer la contribution de l'insertion de diffusion vs latérale en effectuant en parallèle et des FRAP -FLIP »le long des dendrites protocoles adjacents (Fig. 3).

De toute évidence, tandis que les directives spécifiques ont été présentés, chaque laboratoire devra optimiser les paramètres d'imagerie selon les spécimens spécifiques et des équipements. Important, tous les récepteurs de surface dans la ROI doivent être photobleached, indépendante du plan z-axe focal, mais sans endommager phototoxique significative ou non spécifique photoblanchiment. NousERS devrait faire preuve de prudence lorsque l'on tente ce protocole à le corps cellulaire, comme le pourcentage élevé de compartiments intracellulaires de pH relativement faible se traduit généralement par fluorescence de fond élevé dans ces régions. En outre, tandis que nous avons montré comment cette technique peut être appliquée de diverses manières, avant de commencer les expériences de photoblanchiment sélectifs sur une nouvelle SEP-étiqueté de construire, nous vous informons que la caractérisation initiale des récepteurs marqués est d'abord menée, tel que décrit par Ashby et al ^2.

Dans l'ensemble, cette méthode est une adaptation puissante et polyvalente du protocole FRAP standard, permettant des événements d'insertion dans la membrane plasmique à être évalués en temps quasi réel.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
24mm glass coverslips	VWR International	631-0161
Poly-l-lysine	Sigma	P2636	1mg/ml in borate buffer to coat coverslips
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% in neuronal plating and feeding medium
Penicillin Streptomycin	Sigma	P0781	1% in neuronal plating and feeding medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM in plating/feeding medium
Horse Serum	Biosera	DH-291H	10% in neuronal plating media only
pSIN ReP5 cloning vector	Invitrogen	K75001	For Sindbis virus production
LSM510 META confocal system	Zeiss
Image J Software	NIH		open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/