Laterale Diffusion und Exozytose von Membranproteinen in kultivierten Neuronen Veranlagte mit Fluorescence Recovery-und Fluoreszenz-Verlust Photobleaching

Summary

Dieser Bericht beschreibt die Verwendung von Live Cell Imaging und Photobleichmittels Techniken, um die Oberfläche Ausdruck, Transportwege und-handel Kinetik der exogen exprimiert, pH-sensitiven GFP-markierten Proteine ​​an der Plasmamembran von Nervenzellen zu ermitteln.

Abstract

<p class="jove_content"> Membranproteine ​​wie Rezeptoren und Ionenkanäle unterziehen aktiven Handel mit Neuronen, die stark polarisiert und morphologisch komplex sind. Diese gerichtete Menschenhandel ist von fundamentaler Bedeutung zu liefern, zu erhalten oder zu entfernen synaptischer Proteine.</p><p class="jove_content"> Super-Ekliptik im Gegensatz zu GFP (SEP) ist eine pH-sensitive Derivat des eGFP wurde ausgiebig für Live Cell Imaging von Plasmamembranproteinen verwendet^1-2. Bei niedrigen pH-Wert sinkt Protonierung September Photonen-Absorption und Fluoreszenz-Emission eliminiert. Da die meisten intrazellulären Transport Ereignisse in Fächer mit niedrigem pH-Wert, wo September Fluoreszenz wird verfinstert, die Fluoreszenz-Signal vom September-markierte Proteine ​​auftreten, ist in erster Linie von der Plasmamembran, wo der September auf einen neutralen pH extrazelluläre Umgebung ausgesetzt ist. Bei einer hohen Intensität September beleuchtet, wie jeder Fluoreszenzfarbstoff, ist irreversibel lichtgeschädigter (photogebleicht)^3-5. Wichtig ist, weil niedrige pH-Photonen-Absorption löscht, nur ausgedrückt Oberfläche gebleicht September können während intrazelluläre September ist unbeeinflusst von der hohen Intensität Beleuchtung werden^10.06.</p><p class="jove_content"> FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) von September-markierten Proteinen ist eine komfortable und leistungsfähige Technik für die Beurteilung der Dynamik von Proteinen an der Plasmamembran. Wenn fluoreszierend markierten Proteine ​​in einem Bereich von Interesse sind gebleicht (ROI) die Rückgewinnung der Fluoreszenz tritt aufgrund der Bewegung des rohen SEP-markierte Proteine ​​in der gebleichten Region. Dies kann durch laterale Diffusion und / oder von Exozytose nicht photogebleicht Rezeptoren entweder durch zugeführt auftreten<em> De-novo-</em> Synthese oder Recycling (siehe Abb. 1). Der Anteil der bewegliche und unbewegliche Proteins bestimmt werden und die Mobilität und die Kinetik des diffusionsfähigen Fraktion kann unter basalen und stimulierten Bedingungen wie Agonisten Anwendung oder neuronale Aktivierung Reize wie NMDA oder KCl-Anwendung abgefragt werden^8,10.</p><p class="jove_content"> Wir beschreiben Photobleaching Techniken entwickelt, um selektiv visualisieren die Erholung der Fluoreszenz zuzuschreiben Exozytose. Kurz gesagt, wird ein ROI einmal als mit Standard-Protokollen FRAP gebleicht, gefolgt, nach einer kurzen Erholung, durch wiederholtes Bleichen der flankierenden Regionen. Diese "FRAP-Flip 'Protokoll, in unserem Labor entwickelt, wurde genutzt, um AMPA-Rezeptor-Handel bei dendritischen Dornen charakterisieren¹⁰, Und ist anwendbar auf eine Vielzahl von Studien zur Bekämpfung den intrazellulären Transport und der Exozytose zu bewerten.</p>

Protocol

1. Cell Culture, virale Transduktion, und Protein Expression Kultur mit hoher Dichte hippocampalen Neuronen aus embryonalen Tag 18 (E18) Rattenbabys auf Poly-L-Lysin-beschichtete Deckgläser für 14-25 Tage in vitro (DIV). 6-24 Std. vor der Live-Experimente, transduzieren Zellen mit verminderter Sindbis-Virus enthält, der das Membranprotein von Interesse, mit dem Super-Ekliptik im Gegensatz zu GFP (SEP) markiert. In den Pseudovirion-Medium direkt auf das Deckglas mit 1 ml konditioniertes Medium und wieder in den Inkubator. Der Titer und die Zeit für die Proteinexpression nach virale Transduktion wird abhängig von der Charge-Virus und sollte für jede Charge vor Beginn lebenden Zellen ermittelt werden. 2. FRAP-FLIP Live Cell Imaging Gerätesatz-up Übertragen Sie das Deckglas auf dem Imaging-Kammer eines Zeiss Axiovert LSM 510 META konfokalen Mikroskop.Um Leistungsschwankungen während der Bilderzeugung zu minimieren, sicherzustellen, das Mikroskop eingeschaltet ist, mit 100% Laserleistung, für mindestens 20 Minuten vor der Bebilderung. Unmittelbar, ersetzen Sie das Kulturmedium mit vorgewärmten (37 ° C) Aufnahme extrazellulären Lösung mit 140 mM NaCl, 5 mM KCl, 15 mM Glucose, 1,5 mM CaCl 2, 1,5 mM MgCl 2, 20-25 mM HEPES (pH eingestellt 7,4 mit NaOH) und platzieren Sie die Kammer auf der vorgewärmten Bühne (37 ° C) des Zeiss Axiovert. Stellen Sie sicher, die Osmolarität der extrazellulären Recording-Lösung, um innerhalb von 10 mOsM Ihrer Kulturmedium eingestellt. Keine wesentliche Verdampfung auftritt während der Zeitverlauf des Experiments, aber dieses CO 2-unabhängige Lösung für kurze Experimente (<10 stunden). die ergänzung mit 1-2 mm natriumbicarbonat wird empfohlen. definition der parameter image capturing zuerst ermitteln ein neuron expression des rekombinanten proprotein von interesse und bringen sie in den fokus. einem 63x Öl widersprochen, erwerben bild gesamten zelle 488nm laserlicht anregung bei geringer laserleistung. zur minimierung ausbleichen, verwenden einen schnellen nenndrehzahl (7-9) geringen pixel-auflösung (512 bis 512) halten insgesamt scan-geschwindigkeit <1 sekunde. wählen teil dendriten zu zoom, um rahmen dem roi (~ 1,5 2,5 x optischen zoom) erfassen. wo möglich, sicherzustellen, das gesichtsfeld enthält mehrere prozesse, so dass messungen referenz-dendriten erhalten werden kann, festzustellen, ob nicht-spezifische photobleichen aus erwerb auftritt. veränderung filter aus, pinhole, und-verstärkung, maximale fluoreszenz minimal laseranregung aber begrenzter sättigung ermöglichen. großer durchmesser blende empfohlen, photon sammlung maximieren (2 &mgr; m eignet sich für stacheln ternären dendriten). detektor gain sollte stark genug sein, kleinen schritten erkennen,derart, allerersten bilder, vor ausbleichen nicht überwunden 10% gesättigten pixel. speichern diese konfiguration, pre-> Abbildung 1. Schematische Darstellung der Prinzipien der FRAP vs FRAP-FLIP-Protokolle Dieses Diagramm veranschaulicht die Ergebnisse einer regelmäßigen FRAP im Vergleich zu einem 'FRAP-Flip' Protokoll, mit SEP-markierten Rezeptoren. Fluorescence Recovery in traditionellen FRAP ist auf der linken Seite gezeigt. Gemessen Fluoreszenzerholung im zentralen ROI ist eine Kombination der lateralen Diffusion f nicht photogebleicht SEP-markierten Rezeptoren von außerhalb der ROI photogebleicht und Einsetzen von Rezeptoren durch Recycling und / oder De-novo-Exozytose in die dendritische Welle zurückzuführen. Dagegen ist die sich wiederholende photogebleicht der flankierenden ROIs in der rechten Seite dargestellt ist, zeigt, wie diesem modifizierten "FRAP-Flip 'Protokoll Schweigen Erholung durch laterale Diffusion. Als solches kann jede gemessene Fluoreszenz wieder auf direkte Insertion in der ROI zurückgeführt werden. Abbildung 2.Einfügen von SEP-GluA2 in die Plasmamembran auf der dendritischen Welle A) Eine Hippocampus exprimiert SEP-GluA2, selektiv entlang eines Bereichs von Dendriten gebleicht. Die Darstellung zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, während der obere linke Panel unterstreicht die ROIs, die für Photobleaching ausgewählt wurden. Das große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden boxed Regionen, mit Doppelkopf blauen Pfeilen markiert. Diese Tafel zeigt die Dendriten vor Ausbleichen. Der rote Pfeil zeigt die gemessene ROI, in starker Vergrößerung in den unteren Platten gezeigt. B) zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROI über den Zeitverlauf des Experiments, dargestellt als Graupegel in dem ROI (nicht normalisiert). Der schwarze Pfeil markieren Sie den Zeitpunkt der ursprünglichen Photobleichmittels und grüne Pfeil zeigt den Beginn der repetitiven Ausbleichen. &Dgr; Zeigt the Anstieg der Fluoreszenz über der Erholungsphase beobachtet werden, durch Einsetzen der September-GluA2 in den dendritischen Schaft. Nachfolgende niedrigen pH-Wert und pH 7,4 + NH 4 Cl Wäschen bestätigen, dass die Fluoreszenz wieder zu exprimierten Rezeptoren Oberfläche bezieht. Abbildung 3. Recycling & laterale Diffusion vs Recycling von SEP-GluK2 auf der dendritischen Schaft nach Cyclohexamid Behandlung A) Ein Hippocampus ausdrückt SEP-GluK2, selektiv photogebleicht mit parallelen FRAP und 'FRAP-FLIP "Verwertung Protokolle entlang getrennten dendritischen ROIs durchgeführt. Dieses Neuron war Gegenstand einer Vorbehandlung mit Cycloheximid, um die Proteinsynthese (2 Stunden bei 200 ug / ml) zu blockieren. Die Darstellung zeigt die Region von Dendriten, die abgebildet wurde, während die linke Hand Panel Hervorhebung der ROIs, die für Photobleaching ausgewählt wurden. The große weiße Box-Gebiet wurde einst, gebleicht, gefolgt von sich wiederholenden Bleichen der flankierenden Regionen boxed, der unteren Dendriten nur mit zwei Spitzen blauen Pfeilen markiert. Diese Tafel zeigt die Dendriten vor dem Ausbleichen. Rote Pfeile markieren die ROIs in hoher Vergrößerung in B gezeigt), welche die Fluoreszenz Erholung im traditionellen FRAP gegenüber dem 'FRAP-Flip' Protokoll. Ein Vergleich der Werte der Fluoreszenzintensität in der späten Phase der Rückgewinnung (dritte Feld) für den Beitrag der lateralen Diffusion und Recycling gegenüber Recycling allein. C) zeigt die Fluoreszenzintensität in der gemessenen ROIs über den Zeitverlauf des Experiments, dargestellt als normierte Intensität Werte. Der schwarze Pfeil markieren Sie den Zeitpunkt der ursprünglichen Photobleichmittels und grüne Pfeil zeigt den Beginn der repetitiven Ausbleichen. &Dgr; Rec zeigt den Einschwingvorgang durch Rezeptor-Recycling, von der FRAP / FLIP Dendriten bestimmt, während &Dgr;Unterschied wird der Beitrag des lateralen Diffusion von SEP-GluK2 in den dendritischen Welle in der "FRAP nur 'Return on Investment. Die vorübergehende Erhöhung wird durch allmählichen Rückgang der Signal entsprechend dem Herunterfahren der verfügbaren Rezeptoren durch Cycloheximid-Behandlung. Die anschließende niedrigen pH-Wert und pH 7,4 + NH 4 Cl Wäschen bestätigen, dass die Fluoreszenz wieder zu exprimierten Rezeptoren Oberfläche bezieht.

Discussion

Wir beschreiben eine innovative Strategie, um die Komponenten des Plasmas Membranproteinen visualisieren. Der kombinatorische Ansatz von Photobleaching Techniken mit SEP-markierte Protein ermöglicht selektiv Plasmamembran Einfügung Ereignisse zu beurteilen. Durch die kontinuierliche Bleichen die Membranproteine ​​in flankierenden Regionen während der Genesung, beurteilt die "FRAP-Flip 'Methode der Beitrag der Vesikeltransport zur Fluoreszenz Erholung. Dieser neue Ansatz ermöglicht die direkte Aufnahme von Protein Membraninsertion, so dass sowohl die Anzahl der Sub-Laderäumen, in denen Erholung beobachtet wird und die Amplitude der Erholung (AF) im stationären Zustand bestimmt werden. Ferner ermöglicht den Vergleich von FRAP mit und ohne FLIP der Anteil der Verwertung zurückzuführen laterale Diffusion zu berechnen.

Darüber hinaus, im gleichen Experiment können Bereiche von nicht-photogebleicht Dendriten benachbart zu den flankierenden Regionen photogebleichtwährend der Erholungsphase qualitativ beurteilt; Fluoreszenz Verlust in diesen Regionen zu beobachten sein wird durch laterale Diffusion photogebleicht Rezeptoren in diesen nicht-photogebleicht Segmente des Dendriten.

Diese selektive Photobleichen Protokoll kann verwendet werden, um eine Vielzahl von zellulären Transports Verfahren, wie die Charakterisierung excocytosis in der Plasmamembran in definierten Teilbereichen (z. B. Dendriten oder Stacheln) oder die Bewertung des Beitrags der lateralen Diffusion vs Einsetzen durch die parallele FRAP und "FRAP untersuchen -Flip 'Protokolle entlang benachbarten Dendriten (Abb. 3).

Klar, während spezifische Leitlinien präsentiert wurden, wird jedes Labor benötigen Optimierung der Bildparameter nach bestimmten Proben und Ausrüstungen. Wichtig ist, dass alle Oberflächen-Rezeptoren in der ROI zu photogebleicht, unabhängig von der z-Achse Brennebene, jedoch ohne signifikante Beschädigung oder phototoxische unspezifische Ausbleichen. UnsERS sollten Vorsicht walten lassen, wenn versucht wird dieses Protokoll in der Zelle soma, wie den hohen Anteil an relativ niedrigen pH intrazelluläre Kompartimente führt in der Regel hohe Hintergrundfluoreszenz in diesen Regionen. Darüber hinaus, während wir haben gezeigt, wie diese Technik angewendet werden kann in unterschiedlich Wege, vor Beginn der selektiven Bleichexperimenten auf eine neue September-Tag bauen, empfehlen wir, dass eine erste Charakterisierung der ersten markierten Rezeptoren durchgeführt wird, wie von Ashby et al ^2.

Insgesamt ist diese Methode eine leistungsstarke und vielseitige Anpassung der Standard-FRAP-Protokoll, die das Einsetzen Ereignisse in Plasmamembran, um nahezu in Echtzeit ausgewertet werden.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments (optional)
24mm glass coverslips	VWR International	631-0161
Poly-l-lysine	Sigma	P2636	1mg/ml in borate buffer to coat coverslips
Neurobasal Medium	Invitrogen	21103
B27	Invitrogen	17504-044	2% in neuronal plating and feeding medium
Penicillin Streptomycin	Sigma	P0781	1% in neuronal plating and feeding medium
L-Glutamine	Invitrogen	25030	2mM / 0.8mM in plating/feeding medium
Horse Serum	Biosera	DH-291H	10% in neuronal plating media only
pSIN ReP5 cloning vector	Invitrogen	K75001	For Sindbis virus production
LSM510 META confocal system	Zeiss
Image J Software	NIH		open access software. All plugins described herein are available at http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/