本文介绍了一种方法,可视化的全内反射荧光显微镜(TIRF)HIV-1诱导信封上的玻璃支持平面双层病毒学突触的形成。该方法也可以结合免疫荧光染色检测艾滋病毒1信封引起的病毒学突触的形成过程中发生的信号分子的活化和再分配。
人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)感染发生最有效的传输2,10,11细胞通过细胞。这涉及形成一个病毒学突触(VS),这是F-肌动蛋白依赖的细胞与细胞接触被感染的细胞上的HIV-1的gp120信封后形成的交界处,与CD4和细胞之间的CD4 + T细胞的细胞转移(中九龙干线)的趋化因子受体CCR5或CXCR4对靶细胞8。此外gp120和它的受体,其他膜蛋白,特别是粘附分子LFA-1及其配体,细胞间粘附分子家庭,在VS的形成和病毒的传播发挥了重要作用,因为它们是病毒感染的供体细胞的表面上和靶细胞,以及对HIV-1病毒颗粒1,4,5,6,7,13的信封。也伴随着细胞内的信号事件gp120的聘用及其受体转VS形成。事实上,我们最近发现的CD4 <SUP> + gp120与细胞间的相互作用引起招聘的TCR signalosome包括LCK,CD3ζ,ZAP70,土地增值税,SLP-76,ITK,PLCγ15相关的信号分子的磷酸化。
在这篇文章中,我们提出了一个方法,可视化超分子的安排和膜近端信号VS形成过程中发生的事件。我们采取的玻璃支持作为还原模型来表示附有病毒包膜gp120与细胞粘附分子ICAM-1的感染艾滋病毒的细胞表面的平面双向层系统的优势。该协议描述为监测HIV-1的gp120诱导VS集会和信号激活的事件,包括我)双向层在流动单元的筹备和大会,二)注射细胞和免疫荧光染色检测细胞相互作用的细胞内信号分子的一般程序与HIV-1 gp120和ICAM-1的双层,III)TIRF显微镜图像采集,1ND IV)的数据分析。该系统生成VS超越与传统的细胞与细胞系统实现接口的高清晰度图像,因为它允许招募到这些子域与特定信号分子检测VS的单个分子组成不同的集群。
以前的研究已经在细胞与细胞的共轭系统的可视化VS,然而这些研究并没有提供足够高的分辨率的图像可视化在突触的超分子结构。在我们的实验室中,我们利用玻璃平面双层系统的代表表示病毒包膜gp120与细胞粘附分子ICAM-1感染的细胞表面。在TIRF显微镜,这从一个高信号噪声比的双层表面在100-200 nm的荧光信号检测的同时,我们能够探测到从在VS的ICAM-1的gp120的超分子隔离。此外,标准的染色方法可应用于双层系统,用于检测和量化的具体招聘LCK积极,但不是菲英岛,gp120的接触面积比15。因此,平面双层突触界面的高分辨率成像实验系统提供了一个在2D平面的TIRF微SCOPY,以及宽视场或聚焦照明方法。然而,该系统还具有调整配体的流动性,平面弯曲的限制,和生物膜的波动不是由平面双层转载。此外,这是在体外系统,因此有其他限制,如缺乏其他分子膜,这将是对目前受感染的细胞和细胞骨架的机械调节分子的流动性和细胞活力。此外,动态和分布的分子,如三聚体与单体的gp120可能无法代表生理上的双层。不过,即使有了这些限制,这个系统仍然是非常有价值的研究病毒细胞或细胞 – 细胞相互作用,以及这些方法可以作为一个有用的指南,研究人员正在寻求高分辨率图像检测超分子组织,是无法辨别在传统的细胞与细胞的共轭体系。
The authors have nothing to disclose.
这项工作得到了NIH的资助AI071815(光大集团)和路线图奈米发展中心奖PN2EY016586(MLD的)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
His tagged HIV gp120 | Gift from Dr. Cho | DH12 | |
His tagged HIV gp120 | Immune Technology | Various X4 or R5 tropic | |
HSA | Williams Medical Company | 521302 | Human Serum Albumin 25% |
Amicon Ultra Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | Ultracel-30K |
Lck Rabbit mAb | Cell Signaling | 2787 | |
p-Lck Rabbit pAb | Santa Cruz Biotechnology Inc. | Sc-101728 | Tyr 394 |
Fyn Rabbit mAb | Millipore | 04-353 | |
Alexa Fluor 568 2° Ab | Molecular Probes | A11034 | Goat anti-Rabbit IgG (H+L) |
Alexa Fluor 488 | Molecular Probes | A-20000 | carboxylic acid succinimidyl ester |
FCS2 Chamber | Bioptechs | 060319-2-03 | |
Microaqueduct Slide | Bioptechs | 130119-5 | |
30mm Round w/holes | Bioptechs | 1907-08-750 | 0.75mm thick |
Rectangle Gasket | Bioptechs | 1907-1422-250 | 14×24 0.25mm thick |
Tygon Tubing | Bioptechs | 20202275 | 1/16″ (25ft) |
Three-way Stopcock | BioRad | 7328103 | |
Two-way Stopcock | BioRad | 7328102 | |
Sticky Slide I 0.2 Luer | Ibidi | 80168 | |
Cover glasses | Ibidi | 10812 | |
1ml syringe | BD | 309659 | |
DOGS-NTA | Avanti Polar Lipids | 790404C | |
DOPC | Avanti Polar Lipids | 850375C | |
Glass coverslip | Bioptechs | 40-1313-0319 | 40mm |
TIRF microscope | Nikon | ||
ImageJ | National Institutes of Health | http://rsbweb.nih.gov/ij/ |