Kolonisering af Euprymna scolopes Squid ved Vibrio fischeri</em
Summary
Metoden beskriver den procedure, som Hawaiian stumphale blæksprutte,<em> Euprymna scolopes</em> Og bakterielle symbiont,<em> Vibrio fischeri</em> Er hævet separat og indføres derefter for at muliggøre specifik kolonisering af blæksprutte lys organ af bakterierne. Kolonisering påvisning af bakterielt afledte luminescens og ved direkte kolonitælling er beskrevet.
Abstract
Specifikke bakterier findes i association med dyrevæv 1-5. Sådanne værts-bakterielle foreninger (symbioser) kan være skadelig (patogene), har ingen egnethed konsekvens (kommensal), eller være en fordel (mutualistisk). Mens megen opmærksomhed er blevet givet til sygdomsfremkaldende interaktioner, vides kun lidt om de processer, der dikterer den reproducerbare købet af gavnlige / kommensale bakterier fra omgivelserne. Den lys-organ mutualism mellem marine Gram-negativ bakterie V. fischeri og Hawaiian stumphale blæksprutte, E. scolopes, repræsenterer en meget specifik interaktion, hvor en vært (E. scolopes) etablerer et symbiotisk forhold med kun en bakteriearter (V. fischeri) under hele løbet af sin levetid 6,7. Bioluminescens er fremstillet af V. fischeri i denne interaktion tilvejebringer en anti-eliminerende fordel E. scolopes under natlige aktiviteter 8,9, mensdet næringsrige værtsvævet giver V. fischeri med en beskyttet niche 10. Under hver vært generation, er dette forhold gentaget, hvilket repræsenterer en forudsigelig proces, der kan vurderes i detaljer på forskellige stadier af symbiotisk udvikling. I laboratoriet, hvis opsamlet inden for de første 30-60 min og overførtes til symbiont-frit vand juvenile blæksprutte lugen aposymbiotically (uncolonized), og kan ikke blive koloniseret undtagen ved den eksperimentelle inokulum 6. Denne interaktion giver således en nyttig model system til at vurdere de enkelte trin, der fører til konkrete køb af en symbiotisk mikrobe fra miljøet 11,12.
Her beskriver vi en metode til at vurdere graden af kolonisering der opstår, når nyklækkede aposymbiotic E. scolopes udsættes for (kunstige) havvand indeholdende V. fischeri. Denne enkle analyse beskriver podning, naturlig infektion, og inddrivelseaf den bakterielle symbionten fra den spirende lys organ E. scolopes. Care er taget til at give en konsistent miljø for dyrene under symbiotisk udvikling, især med hensyn til vandkvalitet og lette signaler. Metoder til at karakterisere det symbiotiske beskrevne population omfatter (1) måling af bakterielt afledte bioluminescens, og (2) direkte koloni optælling af genvundne symbionter.
Protocol
Discussion
Den kolonisering beskrevne analyse giver mulighed for analyse af en naturlig symbiotisk proces i et kontrolleret laboratorium omgivelser. Som sådan kan den anvendes til at vurdere kolonisering af mutante stammer af forskellige naturlige isolater, og under forskellige kemiske systemer. Variationer i de beskrevne eksperimenter er almindeligt anvendt til at vurdere forskellige aspekter af symbiose. Kinetikken for kolonisering kan måles ved at undersøge luminescens under de første 24 timer, hvilket kan detekteres automa…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Mattias Gyllborg efter blæksprutter facilitet støtte og for kommentarer til dette manuskript, Michael Hadfield og Kewalo Marine Laboratory for hjælp under feltet indsamlingen, og medlemmer af Ruby og McFall-Ngai Laboratorium for bidrag til denne protokol. Arbejdet i Mandel Laboratory understøttes af NSF IOS-0.843.633.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
