Summary

의 식민지 Euprymna scolopes 오징어에 의한 장염 fischeri</em

Published: March 01, 2012
doi:

Summary

방법에 의한 하와이의 꼬리 자른 오징어 절차를 간략하게 설명<em> Euprymna scolopes</em>와 세균성 symbiont,<em> 장염 fischeri</em>, 박테리아에 의한 오징어 표시등 기관의 특정 식민지 수 있도록 도입 별도로하고 사육하고 있습니다. bacterially-파생된 발광에 의한 직접적인 식민지의 계산에 의한 식민지 감지 기능이 설명되어 있습니다.

Abstract

특정 박테리아는 동물 조직을 1-5으로 협회에서 발견된다. 이러한 호스트 세균성 협회는 (symbioses) (병원성) 해로운가 될 수없고 피트니스 결과 (공생)가없는, 또는 (mutualistic) 유익합니다. 많은 관심은 병원성 상호 작용 부여되어 있지만, 거의가 환경에서 공생 / 유익한 박테리아의 재현성 인수를 지시하는 프로세스에 대해 알려져 있습니다. 해양 그람 음성 세균 사이의 가벼운 장기 mutualism V. fischeri와 하와이 꼬리 자른 오징어, E. scolopes는 하나의 호스트 (E. scolopes)는 자사의 일생 6,7의 과정 전반에 걸쳐 하나의 세균 종 (V. fischeri)와 공생 관계를 수립하는 매우 구체적인 상호 작용을 나타냅니다. V. 제작한 Bioluminescence 이 상호 작용하는 동안 fischeri는 엑스타시의 안티 육식 혜택을 제공합니다 야행성 활동 8,9scolopes 반면영양이 풍부한 호스트 조직을 제공 V. 보호 틈새 10과 fischeri. 각 호스트 생성하는 동안,이 관계는 따라서 공생 발전의 다양한 단계에서 세부 평가 수있는 예측 가능한 프로세스를 대표 recapitulated있다. 첫 번째 30~60분 내에 수집 symbiont없는 물로 전송하는 경우 실험실에서 청소년 오징어 해치 aposymbiotically (uncolonized), 그리고는, 실험 inoculum 6에 의한 경우를 제외하고 식민지하실 수 없습니다. 이 상호 작용함으로써 환경 11,12의 공생 미생물의 특정 취득으로 이어질 개별 단계를 평가하는하는 유용한 모델 시스템을 제공합니다.

여기 새로 aposymbiotic E.을 꾸몄다고 때 발생하는 식민지의 정도를 평가하는 방법을 설명 scolopes는 (인공)이 포함된 해수에 노출되는 V. fischeri 있습니다.이 간단한 분석은 접종, 자연 감염 및 복구에 대해 설명E.의 초기 조명 장기에서 세균성 symbiont의 scolopes. 케어는 특히 수질과 라이트 단서와 관련하여, 공생 개발하는 동안 동물을위한 일관된 환경을 제공하기 위해 가져옵니다. 설명 공생 인구를 특성화하기위한 방법은 bacterially-파생 bioluminescence (1) 측정 및 회복 symbionts의 계산 (2) 직접 식민지를 포함합니다.

Protocol

1. 세균성 Inocula의 작성 데이 0 오징어 접종, 접시 LBS에 관련된 박테리아 변종 13 한천 이전 이틀. 25-28 ° C에서 하룻밤 사이에 박테리아를 품어. 1 일 각 V. 중 하나를 식민지로 유리 문화 튜브의 중간 세 ML LBS의 예방 감염 fischeri 변형. 백업으로 튜브를 복제 준비합니다. 날 2 (오징어 단계 …

Discussion

설명 식민지 분석은 통제된 실험실 환경에서 자연 공생 프로세스의 분석을 위해 수 있습니다. 따라서, 그것은 서로 다른 자연의 분리에 의한 돌연변이 종자에 의해 서로 다른 화학 정권 아래에서 식민지를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 설명된 실험에서 유사 일반적 공생의 다양한 측면을 평가하는 데 사용됩니다. 식민지의 속도론은 우연 탐지기가 제거된있는 신틸레이션 계수기에서 자동으?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

저자 오징어 시설 지원이 원고에 대한 의견, 마이클 Hadfield 현장 수령시 도움 Kewalo 해양 연구소,이 프로토콜에 기여를위한 루비와 McFall-Ngai 실험실의 구성원에 대한 Gyllborg Mattias 감사드립니다. Mandel 연구소의 작품은 NSF IOS-0843633에 의해 지원됩니다.

Materials

Name of reagent Company Catalogue Number Comments
Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter VWR 47729-580  
Caps for Glass Culture Tubes Fisher NC9807998  
Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 Biowave CO8000 Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used.
GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer Promega E5311 Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder.
GloMax 20/20 Light Standard Promega E5341 For luminometer calibration.
Refractometer, Handheld Foster and Smith Aquatics CD-14035 Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up.
Instant Ocean (artificial seawater concentrate) Foster & Smith Aquatics CD-16881 Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter.
Filtration Unit Nalgene 158-0020 Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters.
Transfer Pipettes Fisher 13-711-9AM Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings.
Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) Comet T9S (9 oz.) Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9.
Drosophila Vials VWR 89092-720 Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT.
1.5 ml Microcentrifuge Tubes ISC Bioexpress C-3217-1CS Tubes must fit the shape of the pestles.
Ethanol, 200 Proof Fisher BP2818-100  
Pestles Kimble Chase/Kontes 749521-1500  
Plating Beads, 5 mm diameter Kimble Chase 13500 5 Prepare 5 per tube and autoclave.

References

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
  2. Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
  3. Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
  4. Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
  5. Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
  6. Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
  7. Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
  8. McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
  9. Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
  10. Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
  11. Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
  12. Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
  13. Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
  14. Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
  15. Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
  16. Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).

Play Video

Cite This Article
Naughton, L. M., Mandel, M. J. Colonization of Euprymna scolopes Squid by Vibrio fischeri. J. Vis. Exp. (61), e3758, doi:10.3791/3758 (2012).

View Video