Kolonisering av Euprymna scolopes Squid av Vibrio fischeri</em
Summary
Metoden beskriver prosedyren der den hawaiiske Bobtail squid,<em> Euprymna scolopes</em> Og dens bakteriell symbiont,<em> Vibrio fischeri</em>, Er hevet separat og deretter introdusert for å tillate bestemte kolonisering av blekksprut lys orgel av bakterien. Colonization påvisning av bacterially-avledet luminescens og ved direkte koloni telling er beskrevet.
Abstract
Spesifikke bakterier er funnet i sammenheng med animalsk vev 1-5. Slike host-bakterielle foreninger (symbiose) kan være skadelig (patogene), har ingen fitness konsekvens (Commensal), eller være fordelaktig (mutualistic). Mens mye oppmerksomhet har blitt gitt til patogene interaksjoner, er lite kjent om de prosesser som avgjør den reproduserbare oppkjøpet av gunstige / Commensal bakterier fra omgivelsene. Lyset-orgelet mutualism mellom de marine Gram-negative bakterien V. fischeri og den hawaiiske Bobtail squid, E. scolopes, representerer en svært spesifikk interaksjon der en vert (E. scolopes) etablerer et symbiotisk forhold med bare en bakteriearter (V. fischeri) i løpet av sin levetid 6,7. Bioluminesens produsert av V. fischeri løpet av denne interaksjonen gir en anti-rov fordel for E. scolopes under nattlige aktiviteter 8,9, mensden næringsrikt vert vev gir V. fischeri med en beskyttet nisje 10. Under hver vert generasjon, blir dette forholdet rekapitulert, og dermed representerer en forutsigbar prosess som kan vurderes i detalj på ulike stadier av symbiotisk utvikling. I laboratoriet, juvenile blekksprut luke aposymbiotically (uncolonized), og, hvis samlet i løpet av de første 30-60 minutter og overført til symbiont-fritt vann, ikke kan bli kolonisert med unntak av den eksperimentelle podestoff 6. Denne interaksjonen gir dermed en nyttig modell system der for å vurdere de enkelte trinn som fører til spesifikke oppkjøp av et symbiotisk mikrobe fra miljøet 11,12.
Her beskriver vi en metode for å vurdere graden av kolonisering som oppstår når nyklekkede aposymbiotic E. scolopes er utsatt for (kunstig) sjøvann som inneholder V. fischeri. Denne enkle analysen beskriver inokulasjon, naturlig infeksjon, og utvinningav bakteriell symbiont fra den gryende lysorganet E. scolopes. Care er tatt for å gi en konsekvent miljø for dyrene under symbiotisk utvikling, spesielt med hensyn til vannkvalitet og lette signaler. Metoder for å karakterisere det symbiotiske befolkningen beskrevet inkluderer (1) måling av bacterially-avledet bioluminesens, og (2) direkte koloni telling av gjenvunne symbionter.
Protocol
Discussion
Koloniseringen analysen beskrives tillater analyse av et naturlig symbiotisk prosess i et kontrollert miljø laboratorium. Som sådan kan den brukes til å vurdere kolonisering av muterte stammer, av ulike naturlige isolater og under ulike kjemiske regimer. Variasjoner på de eksperimentene som er beskrevet blir ofte brukt til å vurdere ulike sider ved symbiose. Kinetikken av kolonisering kan måles ved å undersøke luminescence under den første 24 timer, noe som kan oppdages automatisk i en scintillation skranke der…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Mattias Gyllborg for blekksprut anlegg støtte og for kommentarer til dette manuskriptet, Michael Hadfield og Kewalo Marine Laboratory for hjelp under felt innsamling, og medlemmer av Ruby og McFall-Ngai Laboratorium for bidrag til denne protokollen. Arbeid i Mandel Laboratory er støttet av NSF IOS-0843633.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
