Kolonisering av Euprymna scolopes Squid genom Vibrio fischeri</em
Summary
Metoden ger det förfarande genom vilket Hawaiian bobtail squid,<em> Euprymna scolopes</em> Och dess bakteriella symbiont,<em> Vibrio fischeri</em>, Höjs separat och sedan introducerades för att tillåta specifik kolonisering av bläckfisk ljusorgan av bakterierna. Colonization upptäckt av bakteriellt härrörande luminiscens och genom direkt koloniräkning beskrivs.
Abstract
Specifika bakterier finns i association med djurvävnad 1-5. Sådana värd-bakteriella föreningar (symbios) kan vara skadligt (patogena), har ingen kondition konsekvens (kommensalism), eller vara till nytta (mutualistic). Även om mycket uppmärksamhet har ägnats åt patogena interaktioner är lite känt om de processer som styr den reproducerbara förvärvet av nyttiga / bakteriefloran från omgivningen. Den Ijus-organet mutualism mellan den marina gramnegativ bakterie V. fischeri och Hawaiian bobtail squid, E. scolopes representerar en mycket specifik växelverkan där en värd (E. scolopes) fastställs ett symbiotiskt förhållande med endast en bakterieart (V. fischeri) under hela dess livstid 6,7. Bioluminiscens produceras av V. fischeri under denna interaktion ger en anti-aggressiv nytta för E. scolopes under nattliga aktiviteter 8,9, medanden näringsrika värdvävnad ger V. fischeri med en skyddad nisch 10. Under varje värd generation är detta förhållande rekapituleras, vilket motsvarar en förutsägbar process som kan bedömas i detalj i olika stadier av symbiotisk utveckling. I laboratoriet, om uppsamlades under de första 30-60 minuter och överfördes till symbiont-fritt vatten till juvenil bläckfisk luckan aposymbiotically (uncolonized), och, inte kan koloniseras förutom genom den experimentella inokulum 6. Denna samverkan ger således en användbar modell system för att bedöma de enskilda stegen som leder till specifika förvärv av ett symbiotiskt mikrob från omgivningen 11,12.
Här beskriver vi en metod för att bedöma graden av kolonisering som uppstår när nykläckta aposymbiotic E. scolopes utsätts för (konstgjord) havsvatten innehållande V. fischeri. Denna enkla analys beskriver ympning, naturlig infektion och återvinningav den bakteriella symbiont från den framväxande ljuset organ E. scolopes. Man ser till att ge en enhetlig miljö för djuren under symbiotisk utveckling, särskilt med avseende på vattenkvalitet och signaler ljus. Metoder för att karakterisera det symbiotiska befolkningen som beskrivs inkluderar (1) mätning av bakteriellt härrörande mareld, och (2) direkt koloniräkning av återvunnet symbionter.
Protocol
Discussion
Koloniseringen analysen som beskrivs möjliggör analys av en naturlig symbiotiskt process i en kontrollerad laboratoriemiljö. Som sådan kan den användas för att bedöma kolonisering av mutanta stammar, från olika naturliga isolat, och under olika kemiska system. Variationer av de beskrivna experimenten användes vanligen för att bedöma olika aspekter av symbios. Kinetiken för kolonisering kan mätas genom att undersöka luminescens under den första 24 h, vilket kan detekteras automatiskt i en scintillationsrä…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Mattias Gyllborg för bläckfisk anläggning stöd och för kommentarer på detta manuskript, Michael Hadfield och Kewalo Marine Laboratory om hjälp vid fältet insamling, och medlemmar av Ruby och McFall-Ngai Laboratoriet för bidrag till detta protokoll. Arbetet i Mandel laboratoriet stöds av NSF IOS-0.843.633.
Materials
| Name of reagent | Company | Catalogue Number | Comments |
| Glass Culture Tubes, 16 mm Diameter | VWR | 47729-580 | |
| Caps for Glass Culture Tubes | Fisher | NC9807998 | |
| Visible Spectrophotometer for Determination of OD600 | Biowave | CO8000 | Any spectrophotometer capable of measuring OD600 will work. This unit can measure the OD600 of liquid directly in the glass culture tubes. Some adjustment of the inoculum calculation may be necessary depending on the instrument used. |
| GloMax 20/20 Single-Tube Luminometer | Promega | E5311 | Equivalent to the Turner BioSystems 20/20n Luminometer. Includes the microcentrifuge tube holder. |
| GloMax 20/20 Light Standard | Promega | E5341 | For luminometer calibration. |
| Refractometer, Handheld | Foster and Smith Aquatics | CD-14035 | Calibrate before each use with deionized water. Rinse after every use with deionized water to prevent salt build-up. |
| Instant Ocean (artificial seawater concentrate) | Foster & Smith Aquatics | CD-16881 | Prepare at 35 ‰ in deionized water, using the refractometer, then filter through a 0.2 μm SFCA filter. |
| Filtration Unit | Nalgene | 158-0020 | Surfactant-free cellulose acetate (SFCA) membrane, 0.2 μm. We have observed variable results with some surfactant-containing PES filters. |
| Transfer Pipettes | Fisher | 13-711-9AM | Using scissors or razor blade, cut the tip cleanly above the first ridge to increase the diameter of the pipette tip and avoid squeezing the squid hatchlings. |
| Disposable Sample Bowls (plastic tumblers) | Comet | T9S (9 oz.) | Bowls for inoculation, with upper diameter 3 ¼”, lower diameter 2 ¼”, height 3″. Bowls create a homogenous environment as they have no bottom rim, in which squid can get trapped in a low-oxygen niche. The size is optimized for 40-ml inoculum. Available at webstaurantstore.com, #619PI9. |
| Drosophila Vials | VWR | 89092-720 | Vial diameter matches the opening on the luminometer PMT. |
| 1.5 ml Microcentrifuge Tubes | ISC Bioexpress | C-3217-1CS | Tubes must fit the shape of the pestles. |
| Ethanol, 200 Proof | Fisher | BP2818-100 | |
| Pestles | Kimble Chase/Kontes | 749521-1500 | |
| Plating Beads, 5 mm diameter | Kimble Chase | 13500 5 | Prepare 5 per tube and autoclave. |
References
- Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining the normal bacterial flora of the oral cavity. J. Clin. Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
- Mandel, M. J., Wollenberg, M. S., Stabb, E. V., Visick, K. L., Ruby, E. G. A single regulatory gene is sufficient to alter bacterial host range. Nature. 458, 215-218 (2009).
- Grice, E. A., Segre, J. A. The skin microbiome. Nat. Rev. Microbiol. 9, 244-253 (2011).
- Malic, S. Detection and identification of specific bacteria in wound biofilms using peptide nucleic acid fluorescent in situ hybridization (PNA FISH). Microbiology. 155, 2603-2611 (2009).
- Turnbaugh, P. J. The human microbiome project. Nature. 449, 804-810 (2007).
- Nyholm, S. V., McFall-Ngai, M. J. The winnowing: establishing the squid-Vibrio symbiosis. Nat. Rev. Microbiol. 2, 632-642 (2004).
- Ruby, E. G. Lessons from a cooperative, bacterial-animal association: the Vibrio fischeri-Euprymna scolopes light organ symbiosis. Annu. Rev. Microbiol. 50, 591-624 (1996).
- McFall-Ngai, M. J., Ruby, E. G. Symbiont recognition and subsequent morphogenesis as early events in an animal-bacterial mutualism. Science. 254, 1491-1494 (1991).
- Jones, B., Nishiguchi, M. Counterillumination in the Hawaiian bobtail squid, Euprymna scolopes Berry (Mollusca: Cephalopoda). Marine Biology. 144, 1151-1155 (2004).
- Graf, J., Ruby, E. G. Host-derived amino acids support the proliferation of symbiotic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 1818-1822 (1998).
- Ruby, E. G., McFall-Ngai, M. J. A squid that glows in the night: development of an animal-bacterial mutualism. J. Bacteriol. 174, 4865-4870 (1992).
- Lee, P. N., McFall-Ngai, M. J., Callaerts, P., de Couet, H. G. The Hawaiian bobtail squid (Euprymna scolopes): a model to study the molecular basis of eukaryote-prokaryote mutualism and the development and evolution of morphological novelties in cephalopods. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Stabb, E., Visick, K., Millikan, D., Corcoran, A. The Vibrio fischeri-Euprymna scolopes symbiosis: a model marine animal-bacteria interaction. Recent Advances in Marine Science and Technology. , (2001).
- Boettcher, K. J., Ruby, E. G. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna scolopes. J. Bacteriol. 172, 3701-3706 (1990).
- Fidopiastis, P. M., von Boletzky, S., Ruby, E. G. A new niche for Vibrio logei, the predominant light organ symbiont of squids in the genus Sepiola. J. Bacteriol. 180, 59-64 (1998).
- Bose, J. L. Contribution of rapid evolution of the luxR-luxI intergenic region to the diverse bioluminescence outputs of Vibrio fischeri strains isolated from different environments. Appl. Environ. Microbiol. 77, 2445-2457 (2011).
