Isolering av brystkjertelen Epitelceller fra Tredimensjonal Mikset celle Spheroid Co, kultur

Summary

En enkel metode er beskrevet for å analysere effekter av vev fibroblaster på tilknyttede epitelceller. Kombinasjonen av denne metoden og tre-dimensjonale vevskultur kan lette analysen av cellene etter isolasjon fra 3D. Teknikken er aktuelt å celler med varierende malignt potensial, slik systematisk studie av effekten av tumor-assosierte stroma på kreftcellene.

Abstract

Mens enorme innsatsen har gått inn i å identifisere signalveier og molekyler involvert i normale og maligne celle oppførsel ^1-2, mye av dette arbeidet har blitt utført ved hjelp av klassiske to-dimensjonale cellekultur modeller, som gir mulighet for enkel celle manipulering. Det har blitt klart at intracellulære signalveier er påvirket av ekstracellulære styrker, inkludert dimensjonalitet og celle overflatespenning ^3-4. Flere tilnærminger har blitt tatt for å utvikle tredimensjonale modeller som mer nøyaktig representere biologisk vevet arkitektur ^tre. Selv om disse modellene innlemme multi-dimensjonalitet og arkitektoniske påkjenninger, er studiet av påfølgende effekter på cellene mindre lettvinte enn i to-dimensjonal vevskultur grunn av begrensninger på modeller og vanskeligheten med å trekke ut celler for senere analyse.

Den viktige rolle mikromiljøet rundt svulster i tumorigenesis og tumor atferd is stadig anerkjent ^4. Tumor stroma er sammensatt av flere celletyper og ekstracellulære molekyler. Under tumorutviklingen det er toveis signalene mellom tumorceller og stromale celler ^5. Selv om noen faktorer som deltar i tumor-stroma co-evolusjon har blitt identifisert, er det fortsatt behov for å utvikle enkle teknikker for å systematisk identifisere og studere hel rekke av disse signalene ^6. Fibroblaster er den mest tallrike celletype i normal eller tumor-assosierte stromale vev, og bidra til deponering og vedlikehold av basalmembran og parakrine vekstfaktorer ^syv.

Mange grupper har brukt tre dimensjonale kultur systemer for å studere rollen fibroblaster på ulike cellulære funksjoner, deriblant tumor respons på behandling, rekruttering av immunceller, signalmolekyler, spredning, apoptose, angiogenese, og invasjon ^8-15. Vi har optimalisert en enkel metode for assEssing effekten av brystkjertlene fibroblaster på mammary epitelceller ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig ekstracellulær matriks modell for å lage tre-dimensjonale kulturer blandede celle populasjoner (co-kulturer) ^16-22. Med fortsatt co-kulturen cellene danner spheroids med fibroblaster clustering i interiør og epitelceller i hovedsak på utsiden av spheroids og forming flercellede anslag inn i matrisen. Manipulering av fibroblaster som fører til endrede epitelial celle invasivitet lett kan kvantifiseres av endringer i tall og lengde av epitelial anslag ^23. Videre har vi utviklet en metode til å isolere epitelceller av tre-dimensjonal co-kulturen som forenkler analyse av virkningene av fibroblast eksponering på epitelial oppførsel. Vi har funnet at effekten av co-kultur vedvare i uker etter epitelial celle isolasjon, tillater god tid for å utføre flere analyser. Denne metoden er tilpasningsdyktige til cellenevarierende malignt potensial og trenger ingen spesialisert utstyr. Denne teknikken gjør det mulig for hurtig evaluering av in vitro Cellemodeller under flere forhold, og de ​​tilsvarende resultatene kan sammenlignes med in vivo animalsk vev modeller så vel som menneskelige vevsprøver.

Protocol

1. Etablering Tredimensjonale Co, kulturer Dagen før etablere de øvrige kulturer, fjerne Matrigel fra fryseren og tine på is i en 4 ° C kjøleskap over natten. På dagen for forsøket, forberede medium for co-kulturen, som tilsvarer medium for epitelceller som skal brukes (HMEC medium i dette eksemplet: DME/F12 medium med 10% bovint kalveserum, 5 mikrogram / ml Insulin , 1 mikrogram / ml hydrokortison, og 1 ng / ml EGF). Holde mediet på is i minst 1 time forut for blanding med Matrigel. <l…

Discussion

Metoden som presenteres her er en enkel tilnærming til å analysere effektene av stromale fibroblaster på epiteliale celler, inkludert tumor celler. Det tillater for direkte celle-celle interaksjon innenfor en tre-dimensjonal sammenheng som støttes av ekstracellulær basalmembran matrix, samtidig som enkel ekstraksjon av celler fra matrix for videre analyse. Dette kan brukes til studier av tumor-assosierte stroma, som fibroblast linjer kan bli manipulert til å påvirke signalveiene av valg og epiteliale linjer kan v…

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number	Comments
BD Matrigel	BD Biosciences	356237	Phenol-red free
Hyclone Classical Liquid Medium: DMEM F12	ThermoScientific	SH30023.01
Hyclone Bovine Calf Serum	ThermoScientific	SH3007303
Insulin	EMD Chemicals	407709	Dissolve in 0.005N HCl; 0.22 μM filter
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H4001	Dissolve in 50% EtOH; 0.22 μM filter
EGF	Sigma-Aldrich	E9644	Dissolve in 10mM acetic acid; 0.22 μM filter