Den kinetochore är där SAC initierar sin signal övervaka mitotiska segregation av systerkromatider. En metod beskrivs för att visualisera rekrytering och omsättning av en av de kinetochore proteiner och dess samordning med kromosomen rörelsen i<em> Drosophila</em> Embryon med hjälp av en Leica laser scanning konfokala system.
Spindeln montering checkpoint (SAC) mekanism är en aktiv signal, som övervakar samspelet mellan kromosomavvikelser kinetochores och mikrotubuli spindel för att förhindra anafas debut tills kromosomerna är korrekt anslutna. Celler använder denna mekanism för att förhindra aneuploidi eller genomisk instabilitet och därmed cancer och andra mänskliga sjukdomar som fosterskador och Alzheimers 1. Ett antal av de SAC komponenter såsom Mad1, MAD2, Bub1, BubR1, Bub3, Mps1, Zw10 har Rod och Aurora B-kinas har identifierats och de är alla kinetochore dynamiska proteiner 2. Tyder på att den kinetochor är där SAC signalen initieras. SAC främsta rättsliga mål är Cdc20. Cdc20 är en av de väsentliga APC / C (A naphase P RÄMJA C OMPLEX eller C yclosome) aktivatorer 3 och är också en dynamisk kinetochor protein 4-6. När den aktiveras, inhiberar SAC aktiviteten hos enPC / C för att förhindra förstörelse av två viktiga substrat, cyklin B och securin därmed förhindra metafas att anafas övergången 7,8. Exakt hur SAC signalen initieras och monteras på kinetochores och reläas till APC / C för att inhibera dess funktion fortfarande svåra att uppnå.
Drosophila är en extremt lätthanterlig experimentellt system, ett mycket enklare och bättre kunskaper organism jämfört med den mänskliga men som har samma grundläggande processer i gemensamt. Det är kanske en av de bästa organismer som ska användas för bio-imaging studier i levande celler, särskilt för visualisering av de mitotiska händelser i tid och rum, som det tidiga embryot går igenom 13 snabba nukleära division cykler synkront (8-10 minuter För varje cykel vid 25 ° C) och gradvis anordnar kärnorna i en enda monoskikt precis under barken 9.
Här presenterar jag en bio-imaging-metoden att använda transgena Drosophila uttrycksing GFP (Green Fluorescent Protein) eller dess variant-riktade proteiner av intresse och en Leica TCS SP2 konfokala laserscanningsmikroskop för att studera SAC funktion i flugor, genom att visa bilder av GFP fusionsproteiner av några av de SAC komponenter, Cdc20 och MAD2 Såsom exempel.
Protokollet som beskrivs här är en generisk metod för avbildning flyger syncytiala embryon med hjälp av en Leica TCS SP2 konfokala laserskanning mikroskop och kan modifieras för att passa andra mikroskop system och kan även anpassas för att studera andra genfunktioner med Drosophila syncytiala embryon. Vi har använt detta protokoll för att studera många aspekter av spindelenhet checkpoint, dynamik och protein proteolys med hjälp av transgena flugor eller polyklonala antikroppar för att visualisera det protein lokalisering i levande eller fasta prover 4,6,12-14.
Det är enklast att hålla flugorna i nya flaskor fly mat när de samlar in små mängder (~ 10 – 100) av ägg. Detta minskar krångel att göra och förbereda ytterligare äpple plattor juice agar och ägg kammare insamling som beskrivs i andra publikationer 15,16. Tillsatsen av en liten fyrkant av trasigt täckglas glaset i ena änden av limmet remsa på täckglaset gör det mycket lättareför att öppna nålen och bestämma injektionsvolymen genom att justera inställningarna mikroinjektion systemet medan nålen nedsänkning i 10S oljan. Graden av uttorkning av embryot är viktig för framgång injektion för att undvika läckage och underhåll av embryon livskraft, särskilt för de experiment som kräver en lång tid eller när höja tränsformanter efter injektion. Det finns dock inget gyllene regel för exakt hur lång tid uttorkning krävs. Detta varierar från experiment till experiment och beror på mängden av den injicerade lösningen och fuktigheten av arbetsmiljön.
Funktionerna hos en specifik protein av intresse kan manipuleras genom mikroinjektion specifika proteininhibitorer, mono-eller poly-klonala antikroppar mot ett specifikt protein, budbärar-RNA eller fluorescensmärkta peptider under vildtyp eller genetisk bakgrund mutation. Många av dessa muterade linjer eller GFP-märkta transgena linjer är offentligt AVAILABLE från Drosophila lager centrum och de flesta av dem är noterade på Flybase ( http://flybase.org/~~V ) och kan sökas på nätet.
The authors have nothing to disclose.
Detta protokoll har utvecklats under en Wellcome Trust bidrag. Vi tackar Ms Maureen Sinclair för att upprätthålla de fly lager och förbereda flugan mat över åren. Vi vill också tacka Michael Aitchison för hans hjälp och tekniskt stöd i utveckling av detta protokoll.
Essential equipment and reagents:
Confocal imaging system: The imaging system described in this protocol is a Leica TCS SP2 laser scanning confocal inverted microscope system. The method described is also suitable perhaps with some minor modifications for other imaging systems.
Dissecting microscope: We use an Olympus SZX7 with DF PLAPO 1X-4 lens.
Needle puller: Flaming/brown micropipette puller (from Sutter Instrument, Model: P-97).
Microinjection system: An Eppendorf microinjection system is described but any other appropriate system can be used.
Fly food distributor: Jencons Scientific Ltd peristaltic pump.
Reagents:
Ingredients | Weights | 리소스 | Lot No. |
Maize meal | 100.0g | SUMA, UK | |
Brown sugar | 50.0g | Billington’s, UK | |
Dry yeast | 25.0g | DCL YEAST Ltd. UK | |
Agar | 12.5g | Fisher Scientific | 106556 |
Sorbic acid | 0.4g | BDH, VWR International Ltd. UK | 8829310 |
Benzoic acid | 2.9g | Fisher Scientific | 1019599 |
Nipagin (Methyl -4-Hydro xybenzoate) |
0.9g | BDH, VWR International Ltd. UK | K35969015 |
H2O up to 1L |
Table 1. Fly food ingredients.
Holocarbon 700 and 27 oils purchased from Sigma.
Dry yeast: Thomas Allison, UK.
Preparing the heptane glue: Take about 1.5 meters of double-sided Scotch tape, put it into a 15ml Falcon tube with 5ml of heptane and rotate for 3-5 hours or overnight. After that time split into 4 equal aliquots in 1.5 ml eppendorf centrifuge tubes and spin for 5 min at a fast speed in a bench-top centrifuge to remove any debris. Store the heptane glue solution in a 10ml volumetric flask and keep for use. The glue strength will vary according to the concentration and the amounts of the glue used. Normally, the thinner glue produces lesser noisy background when scanned by confocal microscope.