Toprak Mikrobiyal Kalıntı Tayini için Aldononitrile Asetat türevlendirilmiş Glukozamin ve Muramic Asit GC tabanlı Algılama
Summary
Biz, glukozamin ve toprak ekstrakte muramic asit aldonitrile asetat türevlerinin GC-bazlı analizi için bir yöntem tarif protokolü. Kimyasal mekanizmasının aydınlatılması için, biz de türev ve elektron iyonizasyon halinde oluşan iyon parçalarının yapısını onaylamak için bir strateji sunmak.
Abstract
Karakterize eden mikroorganizmalar nicel yaklaşımlar ekosistemler içindeki mikrobik durumu ve işlevini daha geniş bir anlayış için çok önemlidir. Mikrobiyal analiz için güncel yaklaşımlar, geleneksel laboratuvar kültür-bağımlı teknikleri ve doğrudan çıkarma ve bazı biyo 1, 2 belirlenmesi esasına dayanan bu iki içerir. Toprak yaşayan mikrobiyal türlerin çeşitliliği arasında çok az kültüre, dolayısıyla kültür-bağımlı yöntemleri önemli önyargıları, biyomarker analizinde eksik bir sınırlama tanıtmak edilebilir.
Glukozamin, mannosamine, galaktosamin ve muramic asit de toprak sistemleri 3 en önemli unsurlar olan bu glukozamin (en bol) ve muramic asit (benzersiz bakteri hücre dan), canlı ve ölü mikrobiyal kütle hem tedbirler olarak hizmet edilmiştir , 4. Ancak, analiz konusunda bilgi eksikliği bilimsel emsalleri arasında geniş yaygınlaşması kısıtlar. Tüm exi arasındaaldononitrile için, türevlendirme analitik yöntemler sting GC tabanlı analizi takip asetatlar optimum hassas dengeleme açısından iyi bir seçenek olarak ortaya çıkmıştır, hassasiyet, basitlik, numune saklama 5 üzerinde iyi kromatografik ayırma ve kararlılık.
Burada, aldononitrile asetatlar onların dönüşüm sonra topraktan glukozamin ve muramic asit güvenilir ve nispeten basit bir analizi için detaylı bir protokolü sunarız. Protokolü, dört adımdan oluşmaktadır: asit sindirim, örnek arıtma, türevlendirme ve GC belirlenmesi. Adım adım prosedürü eski yayınları 6, 7 göre ayarlanır. Buna ek olarak, yapısal olarak elektron iyonizasyon üzerinde oluşmuş türevi ve iyonu parçacıkları moleküler iyon doğrulamak için bir strateji sunulmaktadır. Biz aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve mur moleküler ağırlıkların belirlenmesi için GC-MS-EI-SİM, LC-ESI-TOF-MS ve izotopik olarak etiketlenmiş bir reaktif uygulananAmic asit; her türevleri 8 iyonu parçacıkları araştırmak için iyon spektrumunda izotop etiketli türevlerinin kütle kayma kullanılır. Teorik aydınlatılması ek olarak, türev ve iyonu parçacıkları moleküler iyon doğrulama δ 13 C ya da biyokimyasal çalışmalarda 9, 10, bu biyolojik iyon parçaları araştırmacılar kullanılarak yararlı olacaktır.
Protocol
Discussion
Aldononitrile asetat türevlendirilmiş glukozamin ve muramic asit analizi için sunulmuş GC-bazlı yöntem toprak ekstrakte bu amino şekerler, ölçmek için göreceli olarak hızlı bir yöntem sağlar. Türevleri kimyasal açıdan kararlı olan ve bir analize tespit edilebilir. Yöntemi toprak örnekleri ile sınırlı değildir, ve non-toprak matris örnekler için basitleştirilmiş olabilir.
Bu yöntemde kullanılan vakum pompası aside dirençli olması için yapılmıştır. Biz da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma DOE Great Lakes Biyoenerji Araştırma Merkezi (DE-FC02-07ER64494 Bilim DOE BER ofis) bağışları ile desteklenmiştir. Biz Dr Xudong Zhang ve protokol tamamlanmasına yardımcı teknik tartışmalar ve değerli yorumlarınız için kendi grubunun üyelerine minnettarız.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| Muramic acid | Sigma-Aldrich | M2503-25MG |
| D-(+)-glucosamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | G1514-100G |
| N-methyl-D-glucamine | Sigma-Aldrich | M2004-500G |
| Myo-inositol | Fisher Scientific | A307003G025 |
| Methanol (dry) | Acros organics | AC326950010 |
| 4-dimethylamino-pyridine | Acros organics | AC148270050 |
| Ethyl acetate | VWR International | BJGC100-4 |
| Hydroxlamine hydrochloride | Fisher Scientific | H330-100 |
| Pyridine | Fisher Scientific | P368-500 |
| Acetic anhydride | Fisher Scientific | A10-100 |
| Dichloromethane (Methylene chloride) | Fisher Scientific | D37-500 |
| Hexane | Fisher Scientific | H303-4 |
| Hydrochloric acid (6M) | Fisher Scientific | S456-4 |
| Hydroxylamine hydrochloride-15N | Icon services | IN5280 |
| Acetic anhydride-2H (D6C4O3) | Acros organics | AC174670050 |
| D-glucose-U-13C | Cambridge isotope lab | CLM-1396-1 |
| Ammonium sufate-15N | Cambridge isotope lab | NLM-713-1 |
| Name of the equipment | Company | Type |
| Rapid-Vap | LabConco | 790002 |
| Vacum pump | KNF Neuberger | D-79112 |
| Hydrolysis flask | Fisher Scientific | 06 423A |
| Derivatization microvial | Fisher Scientific | 06-100E |
| GC | Hewlett-Packard | 6890 |
| MS | Hewlett-Packard | 5972 |
| LC-ESI-TOF-MS | Agilent | An Agilent 1200 series HPLC system coupled to an Agilent LC/MSD-TOF |
References
- Zelles, L. Fatty acid patterns of phospholipids and lipopolysaccharides in the characterisation of microbial communities in soil: a review. Biology and Fertility of Soils. 29, 111-129 (1999).
- Kirk, J. L. Methods of studying soil microbial diversity. Journal of Microbiological Methods. 58, 169-188 (2004).
- Joergensen, R. G., Emmerling, C. Methods for evaluating human impact on soil microorganisms based on their activity, biomass, and diversity in agricultural soils. Journal of Plant Nutrition and Soil Science. 169, 295-309 (2006).
- Guggenberger, G., Frey, S. D., Six, J., Paustian, K., Elliott, E. T. Bacterial and fungal cell-wall residues in conventional and no-tillage agroecosystems. Soil Science Society of America Journal. 63, 1188-1198 (1999).
- Amelung, W., Lal, R., Kimble, J. M., Follett, R. F., Stewart, B. A. . Assessment Methods for Soil Carbon. , 233-270 (2001).
- Guerrant, G. O., Moss, C. W. Determination of monosaccharides as aldononitrile, O-methyloxime, alditol, and cyclitol acetate derivatives by gas-chromatography. Analytical Chemistry. 56, 633-638 (1984).
- Zhang, X., Amelung, W. Gas chromatographic determination of muramic acid, glucosamine, mannosamine, and galactosamine in soils. Soil Biology and Biochemistry. 28, 1201-1206 (1996).
- Liang, C. Investigation of the molecular ion structure for aldononitrile acetate derivatized muramic acid. Journal of Microbiological Methods. 86, 224-230 (2011).
- He, H., Xie, H., Zhang, X. A novel GC/MS technique to assess 15N and 13C incorporation into soil amino sugars. Soil Biology and Biochemistry. 38, 1083-1091 (2006).
- Glaser, B., Gross, S. Compound-specific delta 13C analysis of individual amino sugars – a tool to quantify timing and amount of soil microbial residue stabilization. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 19, 1409-1416 (2005).
- Liang, C., Balser, T. C. Mass spectrometric characterization of amino sugar aldononitrile acetate derivatives used for isotope enrichment assessment of microbial residues. Soil Biology and Biochemistry. 42, 904-909 (2010).
- Liang, C., Pedersen, J. A., Balser, T. C. Aminoglycoside antibiotics may interfere with microbial amino sugar analysis. Journal of Chromatography A. 1216, 5296-5301 (2009).
