Syntese af en<em> In vivo</em> MR-påviselige Apoptose Probe
Summary
Tidlig detektion af apoptose kan identificere udsatte cellepopulationer i en række forskellige sygdomme. Her viser vi en metode til at forbinde en tidlig apoptose-påvisning protein (Annexin V) til et MRI-detekterbart jernoxid nanopartikler (SPIO). Denne metode kan udvides til andre proteiner af interesse at generere MRI-detekterbare molekylær billeddannelse sonder.
Abstract
Cellulær apoptose er et fremtrædende træk ved mange sygdomme, og dette programmeret celledød forekommer typisk, før de kliniske manifestationer af sygdommen er tydelige. Et middel til at påvise apoptose i sine tidligste, reversible etaper vil give en præklinisk 'vindue' i løbet af hvilke forebyggende eller terapeutiske kunne træffes foranstaltninger for at beskytte hjertet fra permanente skader. Vi præsenterer heri en enkel og robust metode til at konjugere human Annexin V (ANX), som ivrigt binder til celler i de tidligste og reversible stadier af apoptose, at superparamagnetisk jernoxid (SPIO) nanopartikler, der tjener som et MRI-detekterbart kontrastmiddel. Konjugeringen Fremgangsmåden begynder med en oxidation af SPIO nanopartikler, som oxideres carboxylgrupper på polysaccharidet skallen af SPIO. Oprenset ANX protein tilsættes derefter i omgivelser med en natriumboratopløsning at lette kovalent interaktion ANX med SPIO i en reducerende buffer. En endelig reduktion skridt med natrium borohydride er udført for at fuldføre reduktionen, og hvorefter reaktionen standses. Ukonjugeret ANX fjernes fra blandingen ved mikrocentrifuge filtrering. Størrelsen og renheden af ANX-SPIO produkt bekræftes ved dynamisk lysspredning (DLS). Denne fremgangsmåde kræver ikke tilsætning til eller ændring af polysaccharidet SPIO skallen, i modsætning til tværbundne jernoxidpartikel konjugationsfremgangsmåder eller biotin-mærkede nanopartikler. Som et resultat er denne fremgangsmåde en enkel, robust fremgangsmåde, som kan udvides til konjugering til andre proteiner af interesse.
Protocol
Discussion
Den beskrevne konjugation fremgangsmåde til at forbinde SPIO til Annexin V udnytter sidekæde amingrupper af Annexin og carboxylgrupperne i den SPIO nanopartikel. Via specifikke oxidations-reduktions-trin, kan kovalent binding af disse forbindelser kan opnås, og den resulterende funktionaliserede nanopartikel kan isoleres. Denne metode kan generaliseres til andre proteiner og nanopartikler af interesse.
De mest kritiske trin er oxidation og reduktion forhold, der udføres i de relevante te…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue # |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5′-phosphate. 생화학. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
