Syntese av en<em> In vivo</em> MR-påvisbare Apoptose Probe
Summary
Tidlig deteksjon av apoptose kan identifisere risikopersoner celle populasjoner i en rekke sykdommer. Her demonstrerer vi en metode for å koble en tidlig apoptose-deteksjon protein (Annexin V) til en MR-påvisbar jernoksid nanopartikler (SPIO). Denne metoden kan utvides til andre proteiner av interesse å generere MRI-sporbare Molecular Imaging sonder.
Abstract
Cellular apoptose er et fremtredende trekk ved mange sykdommer, og dette programmert celledød oppstår vanligvis før kliniske manifestasjoner av sykdommen er tydelig. En måte å oppdage apoptose i de tidligste stadiene, reversible ville ha råd til en pre-klinisk "vindu" hvor forebyggende eller terapeutisk tiltak kan treffes for å beskytte hjertet fra permanent skade. Vi presenterer her en enkel og robust metode for å konjugat menneskelig Annexin V (ANX), som ivrig binder seg til cellene i de tidligste, reversible stadier av apoptose, til superparamagnetiske jernoksid (SPIO) nanopartikler, som fungerer som en MR-detekterbar kontrastmiddel. Den konjugering metoden begynner med en oksidasjon av SPIO nanopartikler, som oksiderer karboksylgrupper på polysakkaridet skallet av SPIO. Renset ANX protein blir deretter lagt i innstillingen av en natrium borate løsning for å lette kovalente samspill av ANX med SPIO i en redusere buffer. En endelig reduksjon takt med natrium borohydride er utført for å fullføre reduksjon, og deretter reaksjonen er slukket. Ukonjugert ANX fjernes fra blandingen av mikrosentrifuge filtrering. Størrelsen og renhet ANX-SPIO produktet er bekreftet av dynamisk lysspredning (DLS). Denne metoden krever ikke tillegg til, eller modifisering av, polysakkaridet SPIO skallet, i motsetning til krysskoblede jernoksid partikkel konjugasjonsforsøkene metoder eller biotin-merket nanopartikler. Som et resultat, representerer denne metoden en enkel, robust tilnærming som kan utvides til konjugering av andre proteiner av interesse.
Protocol
Discussion
Den beskrives konjugering metode for å koble SPIO til Annexin V utnytter sidekjettingen amin grupper av Annexin og karboksylgrupper moieties av SPIO nanopartikler. Gjennom konkrete oksidasjon-reduksjon trinn, kan kovalent kobling av disse forbindelsene kan oppnås, og den resulterende functionalized nanopartikler kan isoleres. Denne metoden kan generaliseres til andre proteiner og nanopartikler av interesse.
De mest kritiske trinnene er de oksidasjon og reduksjon forhold, utført i de aktue…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
National Institutes of Health, NHLBI (RD, PY, PS).
American Heart Association (JL).
Stanford University, VPUE Grant (JL).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalogue # |
| Superparamagnetic iron oxide | Ocean Nanotech, Inc. | ICK-40-005 |
| Doxorubicin | Sigma | D1515-10MG |
| SuperMag Separator | Ocean Nanotech, Inc. | N/A |
| Zetasizer Nano DLS machine | Malvern, Inc | N/A |
References
- Dash, R. A molecular MRI probe to detect treatment of cardiac apoptosis in vivo. Magn. Reson. Med. , (2011).
- Khym, J. X. The reaction of methylamine with periodate-oxidized adenosine 5′-phosphate. 생화학. 2, 344-350 (1963).
- Liu, Y. Y., Yu, Y., Zhang, G. B., Tang, M. F. Preparation, characterization, and controlled release of novel nanoparticles based on MMA/beta-CD copolymers. Macromol. Biosci. 7, 1250-1257 (2007).
- Seo, W. S. FeCo/graphitic-shell nanocrystals as advanced magnetic-resonance-imaging and near-infrared agents. Nat. Mater. 5, 971-976 (2006).
- Hsiao, J. K. Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent: cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level. Magn. Reson. Med. 58, 717-724 (2007).
- Zhao, M., Beauregard, D. A., Loizou, L., Davletov, B., Brindle, K. M. Non-invasive detection of apoptosis using magnetic resonance imaging and a targeted contrast agent. Nat. Med. 7, 1241-1244 (2001).
- van Tilborg, G. A. Internalization of annexin A5-functionalized iron oxide particles by apoptotic Jurkat cells. Contrast Media Mol. Imaging. 4, 24-32 (2009).
- Sosnovik, D. E. Magnetic resonance imaging of cardiomyocyte apoptosis with a novel magneto-optical nanoparticle. Magn. Reson. Med. 54, 718-724 (2005).
- Sosnovik, D. E. Molecular MRI detects low levels of cardiomyocyte apoptosis in a transgenic model of chronic heart failure. Circ. Cardiovasc. Imaging. 2, 468-475 (2009).
- Dumont, E. A. Cardiomyocyte death induced by myocardial ischemia and reperfusion: measurement with recombinant human annexin-V in a mouse model. Circulation. 102, 1564-1568 (2000).
- Blankenberg, F. G. In vivo detection and imaging of phosphatidylserine expression during programmed cell death. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 95, 6349-6354 (1998).
- Schellenberger, E. A., Sosnovik, D., Weissleder, R., Josephson, L. Magneto/optical annexin V, a multimodal protein. Bioconjug. Chem. 15, 1062-1067 (2004).
