Pele da biópsia Explant Cultura para Derivação de primárias fibroblastos humanos

Summary

O protocolo de cultura de explantes de fibroblastos de soco biópsias da pele humana é uma forma tecnicamente robusta e simples para derivar células da pele dentro de 4-8 semanas para o banco de cerca de 15-20 milhões de células em um número baixo passagem.

Abstract

Tecidos e linhas celulares derivadas de um indivíduo com doença são fontes ideais para estudar fenótipos celulares relacionados com a doença. Fibroblastos derivados paciente neste protocolo têm sido utilizados com sucesso na derivação de células-tronco pluripotentes induzidas à doença modelo ^1. Passagens precoce desses fibroblastos também pode ser usado para ensaios funcionais baseados em células a estudar vias específicas de doenças, os mecanismos ² e subsequentes abordagens de rastreio de drogas. A vantagem do protocolo apresentado sobre procedimentos enzimáticos são: 1) a reprodutibilidade da técnica a partir de pequenas quantidades de tecido derivadas de pacientes idosos, por exemplo, os pacientes afectados com a doença de Parkinson, 2) Abordagem tecnicamente simples sobre metodologias desafiantes mais tratamentos enzimáticos, e 3 ) a consideração do tempo: este protocolo leva 15-20 minutos e pode ser realizada imediatamente após a biópsia chegada. Tratamentos enzimáticos pode demorar até 4 horas e têm os problemas deoverdigestion, a redução da viabilidade das células e subsequente fixação das células, quando não tratadas correctamente. Este protocolo descreve a dissecção e a preparação de uma pele humana, de 4 mm de biópsia para derivação de uma cultura de fibroblastos e tem uma elevada taxa de sucesso o que é importante quando se lida com amostras de tecido derivadas de doente. Nesta cultura, os queratinócitos migram para fora do tecido da biópsia dentro da primeira semana após a preparação. Fibroblastos aparecem 7-10 dias após a primeira conseqüência dos queratinócitos. DMEM elevado de glucose suplementado com FBS a 20% favorece o crescimento de fibroblastos de mais de queratinócitos e fibroblastos que crescesse os queratinócitos. Após duas passagens de queratinócitos foram diluídos para fora, resultando em culturas de fibroblastos relativamente homogéneas que expressa o marcador de fibroblastos SERPINH1 (HSP-47). Usando essa abordagem, 15-20 milhões de fibroblastos podem ser obtidas em 4-8 semanas para a banca celular. A dissecção da pele leva cerca de 15-20 min, as células são então monitorizados uma vez por diasob o microscópio, ea mídia é trocada a cada 2-3 dias após o apego e crescimento das células.

Protocol

O perfurador de biópsia de pele obtida usando o procedimento padrão 3 (por exemplo, obtidos com instrumento redondo 4mm Visipunch) deve ser mantido em DMEM completo de 20% de FBS em meio de gelo. Assim que a amostra chegou no laboratório, o processo de biópsia o mais rapidamente possível. 1. Preparação da Pele da biópsia PASSOS 1,1-1,3 devem ser realizados DENTRO DE UM GABINETE DE BIOSSEGURANÇA Prepara-se p…

Representative Results

Queratinócitos crescendo fora das peças de biópsia, assim como 48 horas após a dissecção. Primeiro fibroblastos excrescência pode ser observada cerca de uma semana após o processamento. Uma vez que os poços de ter atingido a confluência, os fibroblastos são passadas por mais duas passagens para chegar a três frascos de 150 centímetros (T150) e as células são criopreservadas. Nós geramos com este método 15-20 milhões de células. Os fibroblastos são positivos para anti-SERPINH1 (também conhecido como …

Discussion

Com este protocolo, as culturas relativamente puras de fibroblastos da pele pode ser obtido. Os fibroblastos têm características morfológicas características de corpos de células fusiformes alongadas, redondas com núcleos de células ovais, e os fibroblastos crescem alinhados e em feixes quando confluentes. Os meios de suporte do crescimento de fibroblastos ao passo que outras populações de células, por exemplo queratinócitos necessitam de suplementos adicionais e factores de crescimento, ou são mito…

Materials

Name of Equipment	Company	Catalogue Number
Dissecting microscope	Leica	S6E
10 cm Tissue Culture Petri dish	VWR	25382-166
6-well Tissue Culture plate	VWR	73520-906
Stainless steel disposable sterile scalpels (2), blade No#15, Miltex	VWR	21909-660
Sterile pointed-tip forceps
50 mL Conical tubes	VWR	21008-940
2 mL Serological Pipettes	VWR	89130-894
5 mL Serological Pipettes	VWR	89130-896
10 mL Serological Pipettes	VWR	89130-898
Pasteur Pipettes	VWR	14672-380

Table A. Table of specific reagents and equipments.

Name of Reagent	Company	Catalogue Number
1X DMEM: High Glucose	Invitrogen/Gibco	11960-069
20% Fetal Bovine Serum	Invitrogen/Gibco	26140-079
1X L-Glutamine	Invitrogen/Gibco	25030-164
1X MEM Non-essential Amino Acids	Invitrogen/Gibco	11140-076
1X Penicillin/Streptomycin	Invitrogen/Gibco	15140-163

Table B. Reagents.