Spatio-temporele Manipulatie van kleine GTPase activiteit bij subcellulaire niveau en op de tijdschaal van seconden in levende cellen
Summary
Werkwijze voor tijdruimtelijke controle kleine GTPase activiteit licht beschreven. Deze methode is gebaseerd op rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en foto-kooien systemen. Optimalisatie van het licht-bestraling kan de ruimtelijk-tijdelijk bestuurd activering van kleine GTPases op het subcellulaire niveau.
Abstract
Dynamische regulatie van de Rho familie van kleine guanosine triphosphatases (GTPases) met veel ruimte en tijd precisie essentieel is voor de verschillende cellulaire functies en gebeurtenissen 1, 2. Hun spatiotemporeel dynamische karakter is geopenbaard door de visualisatie van hun activiteit en lokalisatie in real-time 3. Om dieper inzicht in hun rol in diverse cellulaire functies op moleculair niveau te krijgen, moet verstoring van eiwit de activiteiten van de volgende stap zijn op een precieze subcellulaire locatie en timing.
Om dit doel te bereiken, hebben we een methode ontwikkeld voor licht-geïnduceerde, spatio-temporeel gecontroleerde activatie van kleine GTPases door het combineren van twee technieken: (1) rapamycine-geïnduceerde FKBP-FRB heterodimerisatie en (2) een foto-kooien methode van rapamycine. Met het gebruik van rapamycine-gemedieerde FKBP-FRB heterodimerisatie, hebben we een methode ontwikkeld voor het snel induceerbaar activatie of inactivatie van kleine GTPases including Rac 4 Cdc42 4 RhoA 4 en Ras 5, waarbij rapamycine induceert translocatie van FKBP-gefuseerde GTPases of hun activatoren naar de plasmamembraan waar FRB verankerd. Voor de koppeling met deze heterodimerisatie systeem, hebben we ook een foto-kooien systeem van rapamycine analogen. Een foto-kooi verbinding is een klein molecuul waarvan de activiteit wordt onderdrukt met een photocleavable beschermende groep bekend als een kooi groep. Om heterodimerisatie activiteit volledig onderdrukken, hebben we een gekooide rapamycine dat gebonden is aan een macromolecuul dat de verkregen grote complex niet de plasmamembraan steken, waardoor vrijwel geen achtergrondactiviteit als chemisch dimerizer in cellen 6. Figuur 1 toont een schema van onze systeem. Met de combinatie van deze twee systemen, wij lokaal aangeworven a Rac activator aan de plasmamembraan op een tijdschaal van seconden en bereikt het licht-geïnduceerde Rac activatie aan de subcellulaire level 6.
Protocol
Discussion
We beschreven een techniek die een nieuwe kooi samengestelde werken samen met de FKBP-FRB heterodimerisatie systeem om Rho GTPase activiteit te manipuleren op een precieze subcellulaire locatie op een tijdschaal van seconden.
Er zijn drie beperkingen van deze aanpak. Ten eerste omdat de methode berust op het voorkomen of het laten diffunderen van dimerizer in de plasmamembraan het doel cellulaire locatie moet plasmamembraan of zijn omgeving. Verdere optimalisatie van de chemische structuur v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door NIH financiering van onderzoek (DK090868 en GM092930 aan TI). Er is een octrooi op een gekooide rapamycine analoog.
Materials
| Name of the reagent/equipment | Company | Catalogue number |
| Rapamycin | Tecoland | RAPA99 |
| FuGENE HD | Roche | 04709691001 |
| Avidin | Sigma | A9275-10MG |
| DMSO | Sigma | D2650-5X5ML |
| Size-exclusion column | GE Healthcare | Spin Trap G-25 |
| Glass bottom 8-well chamber | Thermo Scientific | 12-565-47 |
| Inverted Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert200M |
| UV LED light source | Rapp Opto Electronics | UVILED |
| Confocal spinning disk | Yokogawa Electric Corp. | CSU10 |
| CCD camera | Hamamatsu Photonics | ORCA-ER |
| 100x Objective lens | Zeiss | Plan Apochromat |
Synthetic scheme of cRb (Copyright ACS2011) 6
Synthetic conditions: (a) BnBr, K2CO3, DMF (b) f.HNO3, AcOH (c) TFA (d) Propargyl-Br, K2CO3, DMF, (e) glycerol, cat. pTsA, Toluene (f) NaBH3CN, TiCl4, MeCN (g) Tf2O, Pyridin (h) methanol HCl, (i) LiAlH4, THF (j) TsCl, Pyridine, CH2Cl2 (k) NaN3, DMF (l) 8, 2,6-di-t-butylpyridine, CH2Cl2 (m) 13, CuSO4, Ascorbate, 2-propanol, H2O, CH2Cl2.
References
- Etienne-Manneville, S., Hall, A. Rho GTPases in cell biology. Nature. 420, 629-635 (2002).
- Takai, Y., Sasaki, T., Matozaki, T. Small GTP-binding proteins. Physiol. Rev. 81, 153-208 (2001).
- Kiyokawa, E., Aoki, K., Nakamura, T., Matsuda, M. Spatiotemporal regulation of small GTPases as revealed by probes based on the principle of Forster Resonance Energy Transfer (FRET): Implications for signaling and pharmacology. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 51, 337-358 (2011).
- Inoue, T., Heo, W. D., Grimley, J. S., Wandless, T. J., Meyer, T. An inducible translocation strategy to rapidly activate and inhibit small GTPase signaling pathways. Nat. Methods. 2, 415-418 (2005).
- Komatsu, T. Organelle-specific, rapid induction of molecular activities and membrane tethering. Nat. Methods. 7, 206-208 (2010).
- Umeda, N., Ueno, T., Pohlmeyer, C., Nagano, T., Inoue, T. A photocleavable rapamycin conjugate for spatiotemporal control of small GTPase activity. J. Am .Chem. Soc. 133, 12-14 (2011).
- Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 40, 2004-2021 (2001).
- Kennedy, M. J. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat. Methods. 7, 973-975 (2010).
- Levskaya, A., Weiner, O. D., Lim, W. A., Voigt, C. A. Spatiotemporal control of cell signalling using a light-switchable protein interaction. Nature. 461, 997-1001 (2009).
- Wu, Y. I. A genetically encoded photoactivatable Rac controls the motility of living cells. Nature. 461, 104-108 (2009).
- Yazawa, M., Sadaghiani, A. M., Hsueh, B., Dolmetsch, R. E. Induction of protein-protein interactions in live cells using light. Nat. Biotechnol. 27, 941-945 (2009).
- Fegan, A., White, B., Carlson, J. C., Wagner, C. R. Chemically controlled protein assembly: techniques and applications. Chem. Rev. 110, 3315-3336 (2010).
- Suh, B. C., Inoue, T., Meyer, T., Hille, B. Rapid chemically induced changes of PtdIns(4,5)P2 gate KCNQ ion channels. Science. 314, 1454-1457 (2006).
- Varnai, P., Thyagarajan, B., Rohacs, T., Balla, T. Rapidly inducible changes in phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate levels influence multiple regulatory functions of the lipid in intact living cells. J. Cell. Biol. 175, 377-382 (2006).
