الكولسترول الدفق الفحص
Summary
تم تصميم فحص الكولسترول لquantitate معدل هروب رأس المال الكولسترول من الخلايا مثقف وقدرة يقبلون البلازما لقبول نسبة الكولسترول أطلق سراحهم من الخلايا. الفحص يتكون من خلايا وصفها مع موازنة، والكولسترول الكولسترول بين تجمعات داخل الخلايا وإطلاق الكوليسترول في الدم إلى متقبل خارج الخلية.
Abstract
يجب الحفاظ على نسبة الكولسترول من الخلايا في حدود ضيقة جدا، وكثيرا جدا أو قليلا جدا نسبة الكولسترول في نتائج خلية في اختلال الأغشية الخلوية، وموت الخلايا المبرمج ونخر 1. يمكن للخلايا الكولسترول مصدر من تركيب الخلايا والبروتينات الدهنية من البلازما، وعلى حد سواء مصادر كافية لتلبية متطلبات تماما الخلايا للكولسترول. وينظم بإحكام عمليات تركيب الكولسترول وامتصاص وأوجه القصور من الكوليسترول هي 2 نادر. الكولسترول الزائد هو أكثر 3 المشتركة المشكلة. مع استثناء من خلايا الكبد، وبعض الخلايا درجة قشرة الكظر، والخلايا غير قادرة على تتحلل الكولسترول. خلايا ديك خياران للحد من محتواها الكولسترول: لتحويل الكولسترول إلى استرات الكوليسترول، وهو خيار مع قدرة محدودة على الحمولة الزائدة الخلايا مع استرات الكوليسترول أيضا السامة، وهروب رأس المال الكولسترول، وهو خيار مع قدرة غير محدودة على الأرجح. هروب رأس المال الكولسترول هي المواصفاتIFIC العملية التي يتم تنظيمها من قبل عدد من شركات النقل داخل الخلايا، مثل ملزم للاعبي التنس المحترفين كاسيت نقل البروتينات A1 (ABCA1) وG1 (ABCG1) وB1 زبال نوع المستقبلة. ومتقبل طبيعي من الكوليسترول في بلازما عالية الكثافة (HDL) ومنظمة العفو الدولية ئي.
تم تصميم فحص الكولسترول هروب رأس المال إلى quantitate معدل هروب رأس المال الكولسترول من الخلايا مثقف. فهو يقيس قدرة الخلايا للحفاظ على هروب رأس المال الكوليسترول و / أو قدرة على قبول يقبلون بلازما الكولسترول أطلق سراحهم من الخلايا. الفحص يتكون من الخطوات التالية. الخطوة 1: وصفها الكولسترول الخلوي من خلال إضافة إلى مصل الكوليسترول المسمى المحتوية على المديين المتوسط واحتضان مع الخلايا لمدة 24-48 ساعة. ويمكن الجمع بين هذه الخطوة مع التحميل من الخلايا التي تحتوي على الكوليسترول في الدم. الخطوة 2: حضانة الخلايا في مصل الدم خالية من المتوسط للتوازن الكوليسترول باللقاء بين جميع أحواض الكولسترول بين الخلايا. ويمكن الجمع بين هذه المرحلة مع تفعيل الفصل الخلويةolesterol النقل. الخطوة 3: حضانة الخلايا مع متقبل خارج الخلية وتحديد الكميات من حركة الكولسترول من الخلايا التي تحمل علامات للمتقبل. إذا تم استخدام السلائف الكولسترول لتسمية الكولسترول تصنيعه حديثا، وهي الخطوة الرابعة، وتنقية من الكوليسترول، قد يكون مطلوبا.
الفحص توفر المعلومات التالية: (ط) كيف يمكن لعلاج خاص (طفرة، ضربة إلى أسفل، overexpression 1 أو علاج أ) يؤثر على قدرة الخلية إلى هروب رأس المال ونسبة الكولسترول (II) كيفية قدرة يقبلون البلازما لقبول نسبة الكولسترول متضرر من المرض أو العلاج. وغالبا ما تستخدم هذه الطريقة في سياق البحوث القلب والأوعية الدموية، والاضطرابات الأيضية والاعصاب، والأمراض المعدية والصحة الإنجابية.
Protocol
Discussion
تم تصميم الطريقة الموضحة لقياس نسبة الكوليسترول هروب رأس المال لقياس حركة الكولسترول من الخلايا الى متقبل الكوليسترول خارج الخلية. هناك اعتبارات عدة حاسم في فهم هذه المنهجية.
وضع البطاقات التعريفية وموازنة
<p class="jove_content" style=";text-…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من الوطنية للصحة ومجلس البحوث الطبية في أستراليا (NHMRC) (526615 و 545906)، وجزئيا من خلال برنامج منظمة المؤتمر الاسلامي وحكومة فيكتوريا. DS زميل NHMRC.
Materials
| ReagentsCells | HeLa | THP-1 | RAW | HUVEC | BHK-21 | HFF |
| Complete Media | RPMI – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 5% FCS – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 10% FCS – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Serum Free Media | RPMI – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
M199 – 1% L-glutamine – 1% Pen strep – 2% HEPES (1M) – 7% Endothelial cell growth supplement (ECGS) |
DMEM – 1% L-glutamine – 0.2% Pen strep |
|||
| Passage Method | 1 x Trypsin | Suspension | Scrape | 1 x Trypsin | ||
| Passage Ratio | 3:10 | 1:3 | 1:20 | 1:3 | 1:3 | |
| Cell Activation (optional) | TO-901317 – LXR-agonist – Final conc. 4 μM |
|||||
| Other Reagents | phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) – Cell differentiation – Final conc. 0.1μg/ml |
|||||
References
- Tabas, I. Cholesterol in health and disease. J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).
- Brown, M. S., Goldstein, J. L. Cholesterol feedback: from Schoenheimer’s bottle to Scap’s MELADL. J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).
- Tabas, I. Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications. J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).
- Murphy, A. J. High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).
- Mujawar, Z. Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages. PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).
- Patel, S. Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes. J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).
- Shaw, J. A. Infusion of reconstituted high-density lipoprotein leads to acute changes in human atherosclerotic plaque. Circ. Res. 103, 1084-1091 (2008).
- Kekulawala, R. J. Impact of freezing on high-density lipoprotein functionality. Anal. Biochem. 379, 75-77 (2008).
- D’Souza, W. Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein. Circ. Res. 107, 217-227 (2010).
- Tchoua, U. The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport. Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).
- Mukhamedova, N. Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo. J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).
- Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux. 생화학. 46, 9388-9398 (2007).
- Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae. Biochem. J. 358, 79-86 (2001).
- Smyth, I. A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis. PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).
- Fu, Y. Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells. J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).
- Calkin, A. C. Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux. Circulation. 120, 2095-2104 (2009).
