בידול יעיל של תאים עכבר גזע עובריים לתוך הנוירונים המנוע
Summary
פיתחנו פרוטוקול חדש כדי לשפר את היעילות של של בידול חוץ גופית של עובריים של עכברים לתאי גזע לתוך הנוירונים המוטוריים. בתאי גזע עובריים הבדיל רכשה המנוע נוירונים תכונות כפי שמעיד הביטוי של עצביות ומוטוריות סמנים הנוירונים באמצעות טכניקות immunohistochemical.
Abstract
בידול ישירה של גזע עובריים (ES) תאים לתוך תפקודית הנוירונים המוטוריים מהווה משאב מבטיח ללמוד את מנגנוני המחלה, לסנן חומרים תרופתיים חדשים, ולפתח טיפולים חדשים למחלות עצב מוטוריים כגון ניוון שרירים (SMA) וטרשת לרוחב amyotrophic ( ALS). פרוטוקולים רבים כיום להשתמש בשילוב של חומצה רטינואית (RA) ו סוניק הקיפוד (ששש) להבדיל עכבר גזע עובריים (MES) התאים לתוך המנוע נוירונים 1-4. עם זאת, יעילות התמיינות של תאים MES לתוך המנוע נוירונים נפגש רק עם הצלחה בינונית. פיתחנו פרוטוקול שני שלבים 5 בידול זה משפר באופן משמעותי את יעילות בידול לעומת פרוטוקולים שהוקמו זמינה. הצעד הראשון הוא לשפר את תהליך neuralization ידי הוספת noggin צמיחה גורמים פיברובלסטים (FGFs). Noggin הוא המוךפו"גנטי שהולך העצם חלבון (BMP) יריבו, והוא מעורב אינדוקציה עצביתccording מודל ברירת המחדל של neurogenesis ותוצאות בהיווצרותה של דפוסים עצביים הקדמי 6. FGF איתות פועל בסינרגיה עם ספלון של גרימת היווצרות רקמה עצבית באמצעות קידום הזהות עצבית האחורי 7-9. בשלב זה, התאים MES היו טעונים עם ספלון, bFGF, ו FGF-8 למשך יומיים כדי לקדם את הבידול כלפי שושלות עצביים. הצעד השני הוא לגרום מפרט המנוע נוירון. Noggin / FGFs נחשפו תאים MES היו מודגרות עם RA ו אגוניסט ששש, אגוניסט והחליק (SAG), למשך 5 ימים כדי להקל על הדור נוירון מוטורי. כדי לפקח על בידול של בלגן בתוך הנוירונים המוטוריים, השתמשנו בתא ES קו נגזר eGFP עכבר מהונדס המבטא בשליטת היזם המנוע נוירון מסוים Hb9 1. שימוש בפרוטוקול חזקה, השגנו 51 ± 0.8% של יעילות בידול (n = 3, p <0.01, של סטודנטים מבחן t) 5. תוצאות immunofluorescentמכתים הראו כי ה-GFP בתאים + לבטא את הנוירונים המוטוריים סמנים ספציפיים, איילט-1 ו כולין acetyltransferase (צ'אט). פרוטוקול שני שלבים שלנו בידול מספק דרך יעילה להבחין בתאי MES אל הנוירונים המוטוריים השדרה.
Protocol
Discussion
איכות התאים MES הוא הפרמטר הקריטי ביותר עבור הדור יעיל של הנוירונים המוטוריים. תאים MES יש לטפח על PMEF למנוע התמיינות ספונטנית. תוספת של LiF מסייע לשמור על התאים MES במדינה מובחן. ככל שהתאים מתחלקים MES כל 12-15 שעות, בינוני התרבות הופכת תיגמר במהירות יש להחליף מדי יום.
<p class="jove…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
כתב יד זה מוקדש לזכרו של ד"ר וואנג Wenlan שהלך לעולמו ב -26 במאי 2011. אנו מודים ד"ר דאגלס א קר בנדיבות על מתן HBG3 MES תאים המשמשים במחקר זה. עבודה זו מומנה על ידי Nemours, מענק (2 RR016472-10) במסגרת תוכנית INBRE של המרכז הלאומי למשאבי מחקר (NCRR), וכן בפרס מענק COBRE מ NCRR (5 P20 RR020173-05) כדי לתמוך המרכז מחקר ילדים בבית א 'אלפרד duPont החולים לילדים, בווילמינגטון, דלאוור, ארה"ב.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
References
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
