मोटर न्यूरॉन्स में माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के कुशल भेदभाव
Summary
हम एक नए प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए माउस मोटर न्यूरॉन्स में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो में भेदभाव की दक्षता में सुधार. विभेदित ES कोशिकाओं का अधिग्रहण मोटर न्यूरॉन्स सुविधाओं के रूप में neuronal और मोटर न्यूरॉन immunohistochemical तकनीक का उपयोग कर मार्करों की अभिव्यक्ति के द्वारा evidenced.
Abstract
कार्यात्मक मोटर न्यूरॉन्स में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ते) के प्रत्यक्ष भेदभाव रोग तंत्र का अध्ययन करने के लिए नई दवा यौगिकों स्क्रीन, और रीढ़ की हड्डी में पेशी शोष (SMA) के और amyotrophic पार्श्व काठिन्य के रूप में मोटर न्यूरॉन रोगों के लिए नए उपचारों के विकास के लिए एक आशाजनक संसाधन का प्रतिनिधित्व करता है ( ) ए एल एस. कई मौजूदा प्रोटोकॉल retinoic एसिड (आर ए) और ध्वनि हाथी (श्श्श) के एक संयोजन उपयोग में मोटर न्यूरॉन्स 1-4 माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (एमईएस) में अंतर है. हालांकि, भेदभाव दक्षता एमईएस कोशिकाओं मोटर न्यूरॉन्स में केवल मध्यम सफलता के साथ मुलाकात की है. हम भेदभाव दो कदम 5 प्रोटोकॉल उल्लेखनीय है कि वर्तमान में स्थापित प्रोटोकॉल के साथ तुलना में भेदभाव दक्षता में सुधार विकसित किया है. पहला कदम के नोगिन और fibroblast वृद्धि कारक (FGFs) जोड़कर neuralization प्रक्रिया को बढ़ाने के लिए है. नोगिन एक हड्डी morphogenetic प्रोटीन प्रतिपक्षी (बीएमपी) और तंत्रिका प्रेरण में फंसाneurogenesis के और पूर्वकाल तंत्रिका patterning के 6 के गठन में परिणाम का डिफ़ॉल्ट मॉडल को ccording. FGF संकेतन पीछे तंत्रिका 7-9 पहचान को बढ़ावा देने के द्वारा तंत्रिका ऊतक गठन उत्प्रेरण में नोगिन synergistically के साथ काम करता है. इस चरण में, एमईएस कोशिकाओं नोगिन, bFGF, और FGF-8 के साथ दो दिनों के लिए primed थे लिए तंत्रिका प्रजातियों के प्रति भेदभाव को बढ़ावा देने के. दूसरे चरण के लिए मोटर न्यूरॉन विनिर्देश प्रेरित है. नोगिन / MES कोशिकाओं उजागर FGFs आरए और श्श्श agonist, Smoothened की agonist (शिथिलता), के साथ एक और 5 दिनों के लिए incubated रहे थे मोटर न्यूरॉन पीढ़ी की सुविधा. मोटर न्यूरॉन्स में गंदगी के भेदभाव पर नजर रखने के लिए, हम एक ES सेल मोटर न्यूरॉन विशिष्ट प्रमोटर 1 Hb9 के नियंत्रण के अधीन एक ट्रांसजेनिक माउस व्यक्त EGFP से व्युत्पन्न लाइन का इस्तेमाल किया. इस मजबूत प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम 51 हासिल ± भेदभाव दक्षता के 0.8% (n = 3; पी <0.01, छात्र के टी – परीक्षण) 5. परिणाम के immunofluorescent सेधुंधला से पता चला है कि GFP + कोशिकाओं मोटर न्यूरॉन विशिष्ट मार्करों, आइलेट-1 और acetyltransferase choline (चैट) व्यक्त. हमारे दो कदम भेदभाव प्रोटोकॉल रीढ़ की मोटर न्यूरॉन्स में एमईएस कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक कुशल तरीका प्रदान करता है.
Protocol
Discussion
एमईएस कोशिकाओं की गुणवत्ता मोटर न्यूरॉन्स के कुशल पीढ़ी के लिए सबसे महत्वपूर्ण प्राचल है. एमईएस कोशिकाओं PMEF पर खेती किया जाना चाहिए सहज भेदभाव को रोकने के. LIF के अलावा एक undifferentiated राज्य में एमईएस कोशिकाओं ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह पांडुलिपि जो 26 मई, 2011 को निधन हो गया डॉ. Wenlan वांग की स्मृति को समर्पित है. हम उदारता HBG3 एमईएस इस अध्ययन में इस्तेमाल किया कोशिकाओं को प्रदान करने के लिए डॉ. डगलस ए Kerr धन्यवाद. इस काम Nemours के द्वारा वित्त पोषित किया गया था, अनुसंधान संसाधन के लिए राष्ट्रीय केन्द्र (NCRR), और NCRR से Cobre अनुदान पुरस्कार (5 P20 RR020173-05) के लिए केंद्र का समर्थन INBRE कार्यक्रम के तहत अनुदान (2 RR016472 – 10) अल्फ्रेड मैं ड्यूपॉन्ट अस्पताल में बाल चिकित्सा अनुसंधान बच्चों, Wilmington, डेलावेयर, संयुक्त राज्य अमेरिका के लिए.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
References
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