Abbiamo sviluppato un nuovo protocollo per migliorare l'efficienza del differenziamento in vitro delle cellule staminali embrionali di topo in neuroni motori. Le cellule staminali differenziate acquisito motoneuroni presenta come evidenziato dalla espressione di marcatori neuronali e motorie dei neuroni che utilizzano tecniche immunoistochimiche.
Differenziazione diretta delle staminali embrionali (ES) in cellule funzionali motoneuroni rappresenta una risorsa promettente per studiare i meccanismi della malattia, per lo screening di nuovi composti farmacologici, e per sviluppare nuove terapie per malattie del motoneurone come l'atrofia muscolare spinale (SMA) e la sclerosi laterale amiotrofica ( ALS). Molti attuali protocolli utilizzano una combinazione di acido retinoico (RA) e sonic hedgehog (Shh) per differenziare staminali embrionali di topo (MES), le cellule in neuroni motori 1-4. Tuttavia, l'efficienza differenziazione delle cellule SEM nel motore neuroni ha soltanto incontrato con discreto successo. Abbiamo sviluppato un protocollo due fasi differenziazione 5 che migliora significativamente l'efficienza di differenziazione rispetto a protocolli attualmente applicate. Il primo passo è di migliorare il processo neuralization aggiungendo Noggin e fattori di crescita dei fibroblasti (FGF). Noggin è una proteina morfogenetica dell'osso (BMP), antagonista ed è implicato in uno induzione neuraleecondo al modello predefinito di neurogenesi e risulta nella formazione di anteriore patterning neurale 6. FGF segnalazione agisce sinergicamente con Noggin nell'indurre la formazione di tessuto neurale attraverso la promozione di una identità neurale posteriore 7-9. In questa fase, le cellule sono state MES innescato con Noggin, bFGF, e FGF-8 per due giorni per promuovere la differenziazione verso lignaggi neurali. Il secondo passo è quello di indurre le specifiche dei neuroni motori. Noggin / FGFs esposti MES cellule sono state incubate con RA e un agonista Shh, agonista Smoothened (SAG), per altri 5 giorni per facilitare la generazione dei neuroni motori. Per monitorare la differenziazione di MES in neuroni motori, abbiamo utilizzato una linea di cellule ES derivata da un topo transgenico che esprime eGFP sotto il controllo del promotore motore neurone specifico HB9 1. Usando questo protocollo robusto, abbiamo raggiunto 51 ± 0,8% di efficienza differenziazione (n = 3; p <0,01, t di Student-test) 5. I risultati di immunofluorescenzacolorazione ha dimostrato che le cellule GFP + esprimere i marcatori dei motoneuroni specifici, Islet-1 e colina acetiltransferasi (Chat). I nostri due fasi protocollo di differenziazione offre un modo efficace per differenziare le cellule MES in neuroni motori spinali.
La qualità di cellule MES è il parametro più critico per la produzione efficiente di neuroni motori. MES cellule devono essere coltivate in PMEF per prevenire differenziazione spontanea. L'aggiunta di LIF aiuta a mantenere le cellule MES uno stato indifferenziato. Come cellule MES dividere ogni 12-15 ore, il terreno di coltura si esaurisce rapidamente e deve essere sostituito ogni giorno.
Efficiente attivazione del pathway Shh è un parametro critico necessario per indurre motore neur…
The authors have nothing to disclose.
Questo manoscritto è dedicato alla memoria del Dr. Wang Wenlan scomparso il 26 maggio 2011. Ringraziamo il dottor Douglas A. Kerr generosamente per fornire i HBG3 cellule MES usati in questo studio. Questo lavoro è stato finanziato da Nemours, una borsa di studio (2 RR016472-10) nell'ambito del programma INBRE del Centro nazionale per le risorse di ricerca (NCRR), e un premio COBRE borsa di studio del NCRR (5 RR020173 P20-05) per sostenere il Centro per La ricerca pediatrica presso l'Alfred I. duPont Hospital for Children, Wilmington, Delaware, USA.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
PMEF medium | |||
DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
mES medium | |||
DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
Neural Differentiation medium | |||
DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
MND medium (differentiation) | |||
ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
MND medium (Motor Neuron culture) | |||
ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.