Effektiv Differensiering av mus embryonale stamceller i motoriske nevroner

Summary

Vi utviklet en ny protokoll for å forbedre effektiviteten av in vitro differensiering av mus embryonale stamceller inn i motoriske nevroner. De differensierte ES celler kjøpt motor nevroner har bevist ved uttrykk av nevrale og motor neuron markører med immunhistokjemiske teknikker.

Abstract

Direkte differensiering av embryonale stamceller (ES) celler i funksjonelle motoriske nevroner representerer en lovende ressurs for å studere sykdomsmekanismer, for å skjerme nye stoffet forbindelser, og å utvikle nye behandlingsmetoder for motor neuron sykdommer som spinal muskelatrofi (SMA) og amyotrofisk lateral sklerose ( ALS). Mange nåværende protokoller bruke en kombinasjon av retinsyre (RA) og sonic hedgehog (Hysj) for å skille mus embryonale stamceller (MES) celler inn i motor nevroner ^1-4. Imidlertid har differensiering effektiviteten av MES celler i motor nevroner bare møtt med moderat suksess. Vi har utviklet et to-trinns differensiering protokoll ⁵ som vesentlig forbedrer differensiering effektivitet sammenlignet med for tiden etablerte protokoller. Det første trinnet er å forbedre neuralization prosessen ved å legge Noggin og fibroblast vekstfaktorer (FGFs). Noggin er en Benmorfogenetiske protein (BMP) antagonist og er innblandet i nevrale induksjon enccording til standard modell av neurogenesis og resulterer i dannelse av fremre nevrale mønster ^seks. FGF-signalering virker synergistisk med Noggin i inducing nevrale vev dannelse ved å fremme en posterior neural identitet ^7-9. I dette trinnet, ble MES celler primet med Noggin, bFGF, og FGF-8 for to dager for å fremme differensiering mot nevrale linjene. Det andre trinnet er å indusere motor neuron spesifikasjonen. Noggin / FGFs utsatte MES celler ble inkubert med RA og en Shh agonist, glattes agonist (SAG) for ytterligere 5 dager for å lette motoriske nervecellen generasjon. For å overvåke differensiering av rotet til motoriske nevroner, brukte vi en ES celle linje stammer fra en transgen mus som uttrykker eGFP under kontroll av den motoriske nervecellen spesifikk promoter Hb9 ^en. Ved hjelp av denne robuste protokollen, oppnådde vi 51 ± 0,8% av differensiering effektivitet (n = 3, p <0,01, Student t-test) ^5. Resultater fra immunofluorescentfarging viste at GFP + celler uttrykker de motoriske nervecellen spesifikke markører, Islet-1 og kolin acetyltransferase (chat). Vår to-trinns differensiering protokollen gir en effektiv måte å skille MES celler i spinal motoriske nerveceller.

Protocol

1. Trinn 1: Mouse Embryonic Stem (MES) Cell Culture (Timing: 3 dager) 1. Kontaktflate primære embryonale mus fibroblaster (PMEF) Coat fire 100-mm vevskulturstudier retter med gelatin for PMEF vedheft. Legg 8 ml av 0,1% gelatin løsning (StemCell Technologies) til hver rett og Inkuber i 30 min ved romtemperatur. Fjern overflødig gelatin fra retter. Ikke skyll oppvasken. Fortynn en ampulle med mitomycin C-inaktivert PMEF (Millipore) som inneholder ca. 5 x 10 …

Discussion

Kvaliteten av MES celler er den mest kritiske parameteren for effektiv produksjon av motoriske nerveceller. MES cellene må dyrkes på PMEF å hindre spontan differensiering. Tilsetting av LIF bidrar til å opprettholde beskjeden cellene i en udifferensiert tilstand. Som MES celler deler hver 12-15 timer, kulturen medium blir utarmet raskt og må skiftes daglig.

Effektiv aktivering av Hysj veien er en kritisk parameter for å indusere motor neuron spesifikasjonen. Hysj protein (R & D Sys…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Final concentration
PMEF	Millipore	PMEF-H	N.A.
PMEF medium
DMEM	Invitrogen	11965-118	N.A.
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-glutamine	Invitrogen	25030-081	1%
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15240-063	1%
mES medium
DMEM	StemCell Technologies	36250	N.A.
ES Cell-Qualified FBS	Invitrogen	16141-079	15%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleosides	Millipore	ES-008-D	1%
β-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E	0.1 mM
Penicillin/streptomycin	Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	Millipore	LIF2010	10 ng/ml
Neural Differentiation medium
DMEM	StemCell Technologies	36250	N.A.
ES Cult FBS	StemCell Technologies	06905	15%
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-thio glycerol	Sigma-Aldrich	M-6145	1mM
Noggin	Invitrogen	PHC1506	50 ng/ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng/ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng/ml
MND medium (differentiation)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	N.A.
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Ascorbic acid	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillin/streptomycin	Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% in d2H2O
Fibronectin	StemCell Technologies	07159	5 μg/ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml in d2H2O
β-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E	0.1 mM
Retinoic Acid	Sigma-Aldrich	R-2625	1 μM
SAG	EMD Chemicals	566660	1 μM
MND medium (Motor Neuron culture)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	N.A.
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Ascorbic acid	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillin/streptomycin	Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% in d2H2O
Fibronectin	StemCell Technologies	07159	5 μg/ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml in d2H2O
β-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E	0.1 mM
BDNF	R&D Systems	248-BD-005/CF	10 ng/ml
CNTF	R&D Systems	257-NY-010/CF	10 ng/ml
GDNF	R&D Systems	212-GD-010/CF	10 ng/ml
NT-3	R&D Systems	267-N3-005/CF	10 ng/ml

N.A. = Non-applicable.

Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Final Concentration
0.1% Gelatin	StemCell Technologies	07903	N.A.
Poly-DL-ornithine	Sigma-Aldrich	P0421	0.1 mg/ml in d2H2O
Mouse laminin	Millipore	CC095	2 μg/ml in PBS
0.25% Trypsin/EDTA	StemCell Technologies	07901	N.A.
Accumax	Millipore	SCR006	N.A.

N.A. = Non-applicable.

Table 2. Reagents for coating and dissociation.