Эффективное Дифференциация эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны

Summary

Мы разработали новый протокол для повышения эффективности экстракорпорального дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в моторные нейроны. Дифференцированных клеток ES приобретенные моторные нейроны есть о чем свидетельствует выражение нейронов и двигательных нейронов маркеров использованием иммуногистохимических методов.

Abstract

Прямая дифференциации эмбриональных стволовых (ЭС) клеток в функциональных двигательных нейронов представляет собой перспективный ресурс для изучения механизмов болезни, для отбора новых соединений, лекарственных средств и разработать новые методы лечения для моторных нейронов заболеваний, таких как спинальная мышечная атрофия (СМА) и бокового амиотрофического склероза ( ALS). Многие современные протоколы используют комбинацию ретиноевая кислота (RA) и звуковой еж (Тсс), чтобы отличить мышиных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) в моторные нейроны ^1-4. Тем не менее, дифференциация эффективности ЭСК в моторные нейроны только встретился с умеренным успехом. Мы разработали два шага дифференциации протокол ^5, что значительно повышает эффективность дифференциации в настоящее время по сравнению с установленными процедурами. Первый шаг заключается в повышении neuralization процесс, добавив Noggin и фибробластов ростовыми факторами (FGFs). Noggin представляет собой белок, костные морфогенетические (BMP) антагонист и участвует в нервной индукцииccording по умолчанию модель нейрогенеза и приводит к образованию передних нейронные паттерны ^6. FGF сигнализации действует синергически с Noggin в стимулировании формирования нейронной ткани путем содействия задней нейронной идентичности ^7-9. На этом этапе ЭСК клетки загрунтовать Noggin, bFGF и FGF-8 в течение двух дней, чтобы способствовать дифференциации на нейронных линий. На втором этапе, чтобы побудить двигательных нейронов спецификации. Noggin / FGFs подвергаются ЭСК клетки инкубировали с РА и Shh агонист, сглаженным агонистов (SAG), в течение еще 5 дней для облегчения двигательных нейронов поколения. Для контроля за дифференциацию беспорядок в моторные нейроны, мы использовали линию ES клетки, полученные из трансгенных мышей выражения EGFP под контролем двигательных нейронов конкретных промоутер Hb9 ^1. Используя этот надежный протокол, мы достигли 51 ± 0,8% дифференциация эффективности (п = 3, р <0,01, Стьюдента-тест) ^5. Результаты иммунофлуоресцентногоокрашивание показало, что GFP + клеток выразить двигательных нейронов специфических маркеров, остров-1 и холинацетилтрансферазы (чат). Наш двухступенчатый дифференциации протокол обеспечивает эффективный способ дифференцировать ЭСК клетки в спинном моторных нейронов.

Protocol

1. Шаг 1: мышь эмбриональных стволовых (ЭСК) культуры клеток (сроки: 3 дня) 1. Нанесение первичного эмбриональных фибробластов мыши (ПМЭФ) Пальто четыре 100-мм культуры тканей блюда с желатином для адгезии ПМЭФ. Добавить 8 мл 0,1% раствора желатина (StemCell технологий) для каждо?…

Discussion

Качество ЭСК является наиболее важным параметром для эффективного производства моторных нейронов. ЭСК клетки должны быть выращены на ПМЭФ для предотвращения спонтанной дифференцировки. Добавление LIF помогает поддерживать ЭСК клетки в недифференцированное состояние. Как ЭСК клетки ?…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Final concentration
PMEF	Millipore	PMEF-H	N.A.
PMEF medium
DMEM	Invitrogen	11965-118	N.A.
FBS	Invitrogen	16140-071	10%
L-glutamine	Invitrogen	25030-081	1%
Penicillin/streptomycin	Invitrogen	15240-063	1%
mES medium
DMEM	StemCell Technologies	36250	N.A.
ES Cell-Qualified FBS	Invitrogen	16141-079	15%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1%
Nucleosides	Millipore	ES-008-D	1%
β-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E	0.1 mM
Penicillin/streptomycin	Millipore	TMS-AB2-C	1%
LIF	Millipore	LIF2010	10 ng/ml
Neural Differentiation medium
DMEM	StemCell Technologies	36250	N.A.
ES Cult FBS	StemCell Technologies	06905	15%
Non-essential amino acids	Invitrogen	11140-050	1%
Mono-thio glycerol	Sigma-Aldrich	M-6145	1mM
Noggin	Invitrogen	PHC1506	50 ng/ml
FGF-8	Invitrogen	PHG0274	20 ng/ml
bFGF	Invitrogen	PHG0024	20 ng/ml
MND medium (differentiation)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	N.A.
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Ascorbic acid	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillin/streptomycin	Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% in d2H2O
Fibronectin	StemCell Technologies	07159	5 μg/ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml in d2H2O
β-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E	0.1 mM
Retinoic Acid	Sigma-Aldrich	R-2625	1 μM
SAG	EMD Chemicals	566660	1 μM
MND medium (Motor Neuron culture)
ES-Cult Basal Medium-A	StemCell Technologies	5801	N.A.
Knockout serum replacement	Invitrogen	10828-028	10%
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048	1%
ITS Supplement-B	StemCell Technologies	07155	1%
Ascorbic acid	StemCell Technologies	07157	1%
Penicillin/streptomycin	Millipore	TMS-AB2-C	1%
GlutaMax-I	Invitrogen	35050-061	1%
D-glucose	Sigma-Aldrich	G-8270	0.15% in d2H2O
Fibronectin	StemCell Technologies	07159	5 μg/ml
Heparin	Sigma-Aldrich	H3149	20 μg/ml in d2H2O
β-mercaptoethanol	Millipore	ES-007-E	0.1 mM
BDNF	R&D Systems	248-BD-005/CF	10 ng/ml
CNTF	R&D Systems	257-NY-010/CF	10 ng/ml
GDNF	R&D Systems	212-GD-010/CF	10 ng/ml
NT-3	R&D Systems	267-N3-005/CF	10 ng/ml

N.A. = Non-applicable.

Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Final Concentration
0.1% Gelatin	StemCell Technologies	07903	N.A.
Poly-DL-ornithine	Sigma-Aldrich	P0421	0.1 mg/ml in d2H2O
Mouse laminin	Millipore	CC095	2 μg/ml in PBS
0.25% Trypsin/EDTA	StemCell Technologies	07901	N.A.
Accumax	Millipore	SCR006	N.A.

N.A. = Non-applicable.

Table 2. Reagents for coating and dissociation.