La diferenciación eficiente de las células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras
Summary
Hemos desarrollado un nuevo protocolo para mejorar la eficiencia de la diferenciación in vitro de células madre embrionarias de ratón en neuronas motoras. Las células madre embrionarias diferenciadas adquirida cuenta con las neuronas motoras como lo demuestra la expresión de marcadores neuronales de neuronas y el motor mediante técnicas de inmunohistoquímica.
Abstract
La diferenciación directa de las madre embrionarias (ES) las células en las neuronas motoras funcionales representa un recurso promisorio para estudiar mecanismos de la enfermedad, para examinar los nuevos compuestos de drogas, y para desarrollar nuevas terapias para enfermedades de las neuronas motoras como la atrofia muscular espinal (SMA) y la esclerosis lateral amiotrófica ( ALS). Muchos protocolos actuales utilizan una combinación de ácido retinoico (RA) y Sonic hedgehog (Shh) para diferenciar madre embrionarias de ratón (ES) de las células en las neuronas motoras 1-4. Sin embargo, la eficacia de la diferenciación de las células en las neuronas motoras TEr sólo ha tenido un éxito moderado. Hemos desarrollado un protocolo de diferenciación de dos pasos 5 que mejora significativamente la eficiencia diferenciación en comparación con los protocolos establecidos actualmente. El primer paso consiste en mejorar el proceso de neuralization añadiendo Noggin y factores de crecimiento de fibroblastos (FGF). Noggin es una proteína morfogenética ósea (BMP) antagonista y está implicada en la inducción neural unae acuerdo con el modelo por defecto de la neurogénesis y los resultados en la formación de patrones neural anterior 6. FGF señalización actúa sinérgicamente con Noggin en la inducción de la formación de tejido neuronal mediante la promoción de una identidad neuronal posterior 7-9. En este paso, las células fueron TEr imprimado con Noggin, bFGF, y FGF 8-durante dos días para promover la diferenciación hacia linajes neuronales. El segundo paso es inducir motor especificación neurona. Noggin / FGF expuestas las células fueron incubadas con TEr RA y un agonista de Shh, agonista Smoothened (SAG), por otros 5 días para facilitar la generación de neuronas del motor. Para controlar la diferenciación de ETM en neuronas motoras, se utilizó una línea de células ES derivan de un eGFP ratón transgénico que expresa bajo el control del promotor de la neurona motora específica HB9 1. El uso de este protocolo completo, hemos logrado 51 ± 0,8% de la eficiencia de la diferenciación (n = 3, p <0,01, t de Student-test) 5. Los resultados de inmunofluorescenciatinción mostró que las buenas prácticas agrarias + células expresan los marcadores de la neurona motora específicos, Islet-1 y la colina acetiltransferasa (CAT). Nuestro protocolo de dos pasos de diferenciación proporciona una solución eficiente para diferenciar células TEr en neuronas motoras espinales.
Protocol
Discussion
La calidad de las células MES es el parámetro más crítico para la generación eficiente de las neuronas motoras. TEr células deben ser cultivadas en PMEF para impedir la diferenciación espontánea. Además de LIF ayuda a mantener las células MES en un estado indiferenciado. Mientras que las células se dividen cada TEr h 12-15, el medio de cultivo se agota rápidamente y debe ser reemplazado a diario.
Activación eficaz de la vía de Shh es un parámetro crítico necesario para induci…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este manuscrito está dedicado a la memoria del Dr. Wenlan Wang, quien falleció el 26 de mayo de 2011. Se agradece al Dr. Douglas A. Kerr por su generosidad al proporcionar los HBG3 células TEr utilizados en este estudio. Este trabajo fue financiado por Nemours, una subvención (2 RR016472-10) en el marco del programa de INBRE del Centro Nacional para Recursos de Investigación (CNRR), y un premio COBRE subvención de la CNRR (5 P20 RR020173-05) para apoyar el Centro de Investigación Pediátrica en el Alfred I. duPont Hospital para Niños, de Wilmington, Delaware, EE.UU..
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
References
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