Effektiv Differentiering av embryonala stamceller från mus till Motorneuroner
Summary
Vi utvecklade ett nytt protokoll att förbättra effektiviteten av in vitro differentiering av mus embryonala stamceller i motoriska nervceller. De differentierade ES-cellerna förvärvade motoriska neuroner har, vilket framgår av uttryck av neuronala och motor neuron markörer med immunhistokemiska tekniker.
Abstract
Direkt differentiering av embryonala stamceller (ES-celler) till funktionella motoriska nervceller utgör en lovande källa för att studera sjukdomsmekanismer, att screena nya läkemedelssubstanser, och att utveckla nya behandlingar för motor neuron sjukdomar såsom spinal muskelatrofi (SMA) och amyotrofisk lateral skleros ( ALS). Många nuvarande protokoll använder en kombination av retinsyra (RA) och Sonic hedgehog (Shh) för att differentiera från mus embryonala stamceller (MES)-celler i motoriska neuroner 1-4. Har dock differentieringen effektiviteten i MES celler till motoriska neuroner endast mötas med måttlig framgång. Vi har utvecklat en två-stegs differentiering protokoll 5 som avsevärt förbättrar differentieringen effektivitet jämfört med för närvarande fastställda protokoll. Det första steget är att förbättra neuralization processen genom tillsats av noggin och fibroblasttillväxtfaktörer (FGF). Noggin är ett benmorfogenetiskt protein (BMP)-antagonist och är inblandad i neural induktion ennligt standard modell av neurogenes och resulterar i bildningen av främre neurala mönstring 6. FGF signalering fungerar synergistiskt med Noggin att framkalla nervvävnad bildas genom att främja en bakre neural identitet 7-9. I detta steg var MES-celler primade med noggin, bFGF, och FGF-8 i två dagar för att främja differentiering i riktning mot neurala cellinjer. Det andra steget är att förmå motorneuron specifikation. Noggin / FGF exponerade MES-celler inkuberades med RA och Shh agonist, Smoothened agonist (SAG), för ytterligare 5 dagar för att underlätta motorneuron generation. Att övervaka differentiering av MES in motomeuroner, använde vi en linje ES-cell härledd från en transgen mus som uttrycker EGFP under kontroll av den motoriska neuron promotor HB9 1. Med denna robusta protokoll nådde vi 51 ± 0,8% av differentiering verkningsgrad (n = 3, p <0,01, Students t-test) 5. Resultaten från immunfluorescerandefärgning visade att GFP + celler uttrycker de motoriska neuron specifika markörer, Islet-1 och kolinacetyltransferas (ChAT). Våra två steg differentiering protokollet ger ett effektivt sätt att differentiera MES celler i ryggmärgen motoriska nervceller.
Protocol
Discussion
Kvaliteten av MES-celler är den mest kritiska parametern för effektiv generering av motomeuroner. MES celler måste odlas på PMEF att förhindra spontan differentiering. Tillsats av LIF hjälper till att upprätthålla de MES-celler i ett odifferentierat tillstånd. Som MES celler delar varje 12-15 h, odlingsmediet blir slut snabbt och måste bytas dagligen.
Effektiv aktivering av Shh reaktionsvägen är en kritisk parameter som krävs för att inducera motorneuron-specifikationen. Shh pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta manuskript är tillägnad minnet av Dr Wenlan Wang som gick bort den 26 maj 2011. Vi tackar dr Douglas A. Kerr för generöst tillhandahålla HBG3 MES celler som används i denna studie. Detta arbete har finansierats av Nemours, ett bidrag (2 RR016472-10) under INBRE programmet för National Center for Research Resources (NCRR) och en Cobre för beviljande av bidrag från NCRR (5 P20 RR020173-05) för att stödja Centrum för Pediatric Forskning vid Alfred I. duPont Barn-, Wilmington, Delaware, USA.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
References
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
