Effiziente Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen
Summary
Wir entwickelten ein neues Protokoll, um die Effizienz der in vitro Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen zu verbessern. Die differenzierten ES-Zellen erworbenen motorischen Neuronen verfügt wie durch die Expression von neuronalen und motorischen Neurons Marker mit Hilfe von immunhistochemischen Techniken nachgewiesen.
Abstract
Direkte Differenzierung von embryonalen Stammzellen (ES)-Zellen in funktionelle Motoneuronen stellt eine viel versprechende Quelle für Krankheiten Mechanismen zu studieren, zu neuer Wirkstoffe zu screenen und zu neuen Therapien für Motoneuronen-Krankheiten wie zum Beispiel Spinale Muskelatrophie (SMA) und Amyotrophe Lateralsklerose entwickeln ( ALS). Viele aktuelle Protokolle verwenden eine Kombination von Retinsäure (RA) und Sonic Hedgehog (Shh) an embryonalen Stammzellen der Maus (mES) Zellen in Motoneuronen 4.1 differenzieren. Allerdings ist die Effizienz der Differenzierung mES Zellen in Motoneuronen nur mit mäßigem Erfolg erfüllt. Wir haben eine zweistufige Differenzierung Protokoll Nr. 5, das verbessert die Differenzierung Effizienz im Vergleich zu derzeit etablierten Protokollen entwickelt. Der erste Schritt besteht darin, die neuralization durch Zugabe von Noggin und Fibroblasten-Wachstumsfaktoren (FGFs) erweitern. Noggin ist ein knochenmorphogenetisches Protein (BMP)-Antagonisten und in Neuralinduktion gebracht einach der Standard-Modell der Neurogenese und führt zur Bildung der vorderen neuronalen Strukturieren 6. FGF wirkt synergistisch mit Noggin bei der Induktion von Nervengewebe Bildung durch die Förderung einer hinteren neuronalen Identität 9.7. In diesem Schritt wurden mES Zellen mit Noggin, bFGF und FGF-8 für zwei Tage grundiert werden, um neuronale Differenzierung in Richtung Linien zu präsentieren. Der zweite Schritt besteht darin, Motoneuronen-Spezifikation zu induzieren. Noggin / FGFs ausgesetzt mES Zellen wurden mit RA und einer Shh-Agonisten, Agonisten Smoothened (SAG), für weitere 5 Tage inkubiert, um Motoneuronen Generation zu erleichtern. Um die Differenzierung von MES in die Motor-Neuronen zu beobachten, verwendeten wir eine ES-Zelllinie von einer transgenen Maus exprimiert eGFP unter der Kontrolle des Promotors Motoneuronen Hb9 1 abgeleitet. Mit diesem robusten Protokoll erzielten wir 51 ± 0,8% der Differenzierung Effizienz (n = 3, p <0,01, Student t-Test) 5. Die Ergebnisse der ImmunfluoreszenzFärbung zeigte, dass GFP +-Zellen die Motoneuronen spezifische Marker, Islet-1 und Cholin Acetyltransferase (ChAT) auszudrücken. Unsere Zwei-Schritt-Protokoll Differenzierung bietet eine effiziente Möglichkeit an MES-Zellen in spinalen motorischen Neuronen zu differenzieren.
Protocol
Discussion
Die Qualität der mES Zellen ist die kritischen Parameter zur effizienten Erzeugung von Motoneuronen. mES Zellen müssen auf PMEF kultiviert werden, um spontane Differenzierung zu verhindern. Die Zugabe von LIF hilft bei der Erhaltung der die MES-Zellen in einem undifferenzierten Zustand. Als MES-Zellen teilen sich alle 12 bis 15 h wurde das Kulturmedium verarmt rasch und muss täglich ersetzt werden.
Effiziente Aktivierung des Shh-Weg ist ein kritischer Parameter benötigt, um Motoneuronen …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dieses Manuskript ist dem Andenken von Dr. Wenlan Wang, der am 26. Mai 2011 verabschiedet gewidmet. Wir danken Dr. Douglas A. Kerr für die großzügige Bereitstellung der HBG3 mES Zellen in dieser Studie verwendet. Diese Arbeit wurde von Nemours finanziert wird, ein Zuschuss (2 RR016472-10) unter der INBRE Programm des National Center for Research Resources (NCRR) und einem Cobre Gewährung von Finanzhilfen aus dem NCRR (5 RR020173 P20-05) an das Zentrum für Unterstützung Pädiatrische Forschung an der Alfred I. DuPont Hospital for Children, Wilmington, Delaware, USA.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final concentration |
| PMEF | Millipore | PMEF-H | N.A. |
| PMEF medium | |||
| DMEM | Invitrogen | 11965-118 | N.A. |
| FBS | Invitrogen | 16140-071 | 10% |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-081 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15240-063 | 1% |
| mES medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cell-Qualified FBS | Invitrogen | 16141-079 | 15% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Nucleosides | Millipore | ES-008-D | 1% |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| LIF | Millipore | LIF2010 | 10 ng/ml |
| Neural Differentiation medium | |||
| DMEM | StemCell Technologies | 36250 | N.A. |
| ES Cult FBS | StemCell Technologies | 06905 | 15% |
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140-050 | 1% |
| Mono-thio glycerol | Sigma-Aldrich | M-6145 | 1mM |
| Noggin | Invitrogen | PHC1506 | 50 ng/ml |
| FGF-8 | Invitrogen | PHG0274 | 20 ng/ml |
| bFGF | Invitrogen | PHG0024 | 20 ng/ml |
| MND medium (differentiation) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| Retinoic Acid | Sigma-Aldrich | R-2625 | 1 μM |
| SAG | EMD Chemicals | 566660 | 1 μM |
| MND medium (Motor Neuron culture) | |||
| ES-Cult Basal Medium-A | StemCell Technologies | 5801 | N.A. |
| Knockout serum replacement | Invitrogen | 10828-028 | 10% |
| N-2 supplement | Invitrogen | 17502-048 | 1% |
| ITS Supplement-B | StemCell Technologies | 07155 | 1% |
| Ascorbic acid | StemCell Technologies | 07157 | 1% |
| Penicillin/streptomycin | Millipore | TMS-AB2-C | 1% |
| GlutaMax-I | Invitrogen | 35050-061 | 1% |
| D-glucose | Sigma-Aldrich | G-8270 | 0.15% in d2H2O |
| Fibronectin | StemCell Technologies | 07159 | 5 μg/ml |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | 20 μg/ml in d2H2O |
| β-mercaptoethanol | Millipore | ES-007-E | 0.1 mM |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD-005/CF | 10 ng/ml |
| CNTF | R&D Systems | 257-NY-010/CF | 10 ng/ml |
| GDNF | R&D Systems | 212-GD-010/CF | 10 ng/ml |
| NT-3 | R&D Systems | 267-N3-005/CF | 10 ng/ml |
N.A. = Non-applicable.
Table 1. PMEF and Media for mES cell culture or differentiation.
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Final Concentration |
| 0.1% Gelatin | StemCell Technologies | 07903 | N.A. |
| Poly-DL-ornithine | Sigma-Aldrich | P0421 | 0.1 mg/ml in d2H2O |
| Mouse laminin | Millipore | CC095 | 2 μg/ml in PBS |
| 0.25% Trypsin/EDTA | StemCell Technologies | 07901 | N.A. |
| Accumax | Millipore | SCR006 | N.A. |
N.A. = Non-applicable.
Table 2. Reagents for coating and dissociation.
References
- Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons. Cell. 110, 385-397 (2002).
- Miles, G. B. Functional properties of motoneurons derived from mouse embryonic stem cells. J. Neurosci. 24, 7848-7858 (2004).
- Wichterle, H., Peljto, M. Differentiation of mouse embryonic stem cells to spinal motor neurons. Curr. Protoc. Stem Cell. Biol. Chapter 1, Unit 1H.1.1-Unit 1H.1.9 (2008).
- Kiris, E. Embryonic stem cell-derived motoneurons provide a highly sensitive cell culture model for botulinum neurotoxin studies, with implications for high-throughput drug discovery. Stem Cell Res. 6, 195-205 (2011).
- Wu, C. Y. Proteomic assessment of a cell model of spinal muscular atrophy. BMC Neurosci. 12, 25 (2011).
- McMahon, J. A. Noggin-mediated antagonism of BMP signaling is required for growth and patterning of the neural tube and somite. Genes Dev. 12, 1438-1452 (1998).
- Storey, K. G. Early posterior neural tissue is induced by FGF in the chick embryo. Development. 125, 473-484 (1998).
- Launay, C., Fromentoux, V., Shi, D. L., Boucaut, J. C. A truncated FGF receptor blocks neural induction by endogenous Xenopus inducers. Development. 122, 869-880 (1996).
- Sinha, S., Chen, J. K. Purmorphamine activates the Hedgehog pathway by targeting Smoothened. Nat. Chem. Biol. 2, 29-30 (2006).
- Chen, J. K., Taipale, J., Young, K. E., Maiti, T., Beachy, P. A. Small molecule modulation of Smoothened activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 14071-14076 (2002).
- Lee, S. M., Danielian, P. S., Fritzsch, B., McMahon, A. P. Evidence that FGF8 signaling from the midbrain-hindbrain junction regulates growth and polarity in the developing midbrain. Development. 124, 959-969 (1997).
