Ingeniería y Evolución de la sintética virus adeno-asociado (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia transposición de ADN

Summary

Se demuestra la técnica básica para diseñar y evolucionar molecularmente sintéticos virales adeno-asociados (AAV) vectores de terapia génica a través de la familia de ADN arrastrando los pies. Por otra parte, nos proporcionan las pautas generales y ejemplos representativos para la selección y el análisis de cada uno de cápsidas quiméricas con propiedades mejoradas en las células diana en la cultura o en ratones.

Abstract

Virales adeno-asociados (AAV) vectores representan algunos de los vehículos más potentes y prometedores para la transferencia de gen terapéutico humano debido a una combinación única de propiedades beneficiosas ^1. Estos incluyen el apathogenicity de los virus de tipo salvaje subyacentes y las metodologías muy avanzadas para la producción de alto título, de alta pureza y de grado clínico vectores recombinantes ^2. Una ventaja adicional particular del sistema de AAV sobre otros virus es la disponibilidad de una riqueza de origen natural serotipos que difieren en propiedades esenciales sin embargo, todos pueden ser fácilmente diseñado como vectores utilizando un protocolo común ^1,2. Por otra parte, una serie de grupos, entre ellos el nuestro han creado recientemente las estrategias a utilizar estos virus naturales como plantillas para la creación de vectores sintéticos que, o bien se combinan los activos de los serotipos de entrada múltiples, o que mejorar las propiedades de un solo aislamiento. Las respectivas tecnologías para lograr estos objetivos are ADN de la familia ya sea arrastrando los pies ^3, es decir, la fragmentación de los diversos genes de la cápsida AAV, seguida de su nuevo montaje basado en homologías parciales (normalmente> 80% para la mayoría de los serotipos de AAV), o de visualización ^4,5 péptido, la inserción es decir, que suele ser de siete aminoácidos en un bucle expuesta de la cápsida viral donde el péptido idealmente media re-dirigida a un tipo de célula deseado. Para el mayor éxito posible, ambos métodos se aplican de un modo de alto rendimiento por el que los protocolos están en mayor escala para producir las bibliotecas de alrededor de un millón de variantes diferentes cápside. Cada clon es entonces compuesto de una combinación única de numerosos virus parentales (ADN enfoque arrastrando los pies) o contiene un péptido distintivo en la columna vertebral misma viral (enfoque pantalla péptido). El paso final es iterativo subsiguiente selección de dicha biblioteca sobre las células diana a fin de enriquecer para cápsidas individuales que cumplan la mayoría o idealmente todos los requisitos del proceso de selección. Este último preferiblemente peineines presión positiva, como el crecimiento en un cierto tipo de células de interés, con selección negativa, por ejemplo la eliminación de todas las cápsidas que reaccionan con anticuerpos anti-AAV. Esta combinación aumenta las posibilidades de que cápsidas sintéticos que sobreviven a la selección coincidan con las necesidades de la aplicación dada de una manera que probablemente no se han encontrado en cualquier forma natural AAV aislar. Aquí, nos centramos en el método de ADN de la familia arrastrando los pies como la teórica y experimentalmente más difícil de las dos tecnologías. Se describe y demostrar todos los pasos esenciales para la generación y selección de las bibliotecas barajan AAV (Fig. 1), y luego discutir las dificultades y los aspectos críticos de los protocolos que hay que tener en cuenta a fin de tener éxito con la evolución molecular de AAV.

Protocol

1. Preparación de los Juegos de plásmido que codifica los genes de la cápsida AAV Para facilitar la preparación de rutina de cantidades suficientes de los diversos AAV cápside (PAC) los genes de ADN posterior arrastrando los pies, en un principio subclonar estos genes en un plásmido columna vertebral común. Es importante incluir idénticas secuencias flanqueantes de> 20 nucleótidos para su uso posterior como sitios de unión del cebador para PCR y para la clonación (Fig. 2).</stro…

Discussion

En este sentido, hemos delineado los pasos esenciales de experimentación y directrices para la AAV cápside de ingeniería a través de la familia de ADN revolver y para la evolución de las células o en animales. En esencia, estos protocolos son versiones estándar de los procedimientos se informó por primera en el campo de AAV en 2008 ^3. Mientras que un aluvión de estudios de seguimiento por otros han informado de numerosas modificaciones, por ejemplo, ^10-13, nuestras versiones actua…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number
DNase I	Invitrogen	18068-015
Polyethylenimine (PEI)	Sigma-Aldrich	408727
Restriction enzymes	NEB	Various
T4 DNA Ligase	NEB	M0202T
Gel extraction kit	Qiagen	28704
Phusion II polymerase Kit	Finnzymes (NEB)	F-540S
HotStar Hifi polymerase Kit	Qiagen	202602
DMSO	Finnzymes (NEB)	F-540S (part of kit)
EDTA (25 mM)	Invitrogen	18068-015 (part of kit)
Tris	Roth	4855.2
Ampicilin sodium salt	Roth	K029.2
dNTPs (10 mM, 100 μl)	Invitrogen	18427013
Iodixanol (OptiPrep)	Axis-shield	1114739
Phenolred	Merck	107241
Plasmid mega prep kit	Qiagen	12181
Ultracentrifuge	Beckman-Coulter	Optima L90K
Quick-Seal centrifuge tubes	Beckman-Coulter	342414
Electroporation unit	Bio-Rad	GenePulserXcell
Thermal cycler	Eppendorf	Vapo Protect
Heating block	BIOER	MB-102
Fluorescence microscope	Olympus	IX81
FACS analyser	Beckman-Coulter	Cytomics FC500 MLP
MegaX DH10B T1R cells	Invitrogen	C640003
Benzonase	Merck	101695
Adenovirus-5	ATCC	VR-5
pBlueScript II KS(+) plasmid	Stratagene	212207
cap5F (Pac I site in yellow, cap5-specific sequences in bold): GACTCTTAATTAACAGGTATGTCTTTTGTTGATCACCCTCC	IDTDNA	Custom primer
cap5R (Asc I site in green, cap5-specific sequences in bold): GTGAGGGCGCGCCTTAAAGGGGTCGGGTAAGGTATC	IDTDNA	Custom primer