I denne artikkelen viser vi analyser for å studere termiske nociception i<em> Drosophila</em> Larver. En analysen innebærer romlig-begrenset (lokal) stimulering av termiske nociceptors<sup> 1,2</sup> Mens andre innebærer en grossist (global) aktivering av de fleste eller alle slike nevroner<sup> 3</sup>. Sammen utgjør disse teknikkene tillater visualisering og kvantifisering av de atferdsmessige funksjoner<em> Drosophila</em> Nociceptive sensoriske nevroner.
I denne artikkelen viser vi analyser for å studere termiske nociception i Drosophila larver. En analysen innebærer romlig-begrenset (lokal) stimulering av termisk nociceptors 1,2 mens den andre innebærer en grossist (global) aktivering av de fleste eller alle slike nevroner 3. Sammen utgjør disse teknikkene tillater visualisering og kvantifisering av de atferdsmessige funksjoner Drosophila nociceptive sensoriske nevroner.
Den Drosophila larven er en etablert modell for å studere termiske nociception, en sensorisk respons på potensielt skadelige temperaturer som er evolusjonært bevares over arter 1,2. Fordelene med Drosophila for slike studier er den relative enkelhet av sin nervesystemet og raffinement av de genetiske teknikker som kan brukes til å dissekere den molekylære basisen for den underliggende biologi 4-6 i Drosophila, som i alle metazoans de response til skadelige termiske stimuli innebærer generelt en "nocifensive" motvilje uttak til den framlagte stimulus 7. Slike stimuli oppdages gjennom frie nerveender eller nociceptors og amplitude i organismebiologi responsen avhenger av antall nociceptors mottar skadelige stimulus 8. I Drosophila, er det klasse IV dendrittiske arborization sensoriske nevroner som gjenkjenner skadelige termiske og mekaniske stimuli 9 i tillegg til sin nylig oppdaget rolle som fotoreseptorene 10. Disse nevroner, som har blitt meget godt undersøkt på utviklingsnivå, arborize over barrieren epidermal arket og knytte kontakter med nesten alle epidermale celler 11,12. Singelen axon av hver klasse IV Nevron prosjekter i ventrale nerve ledningen av det sentrale nervesystemet 11 hvor de kan koble seg til andre-ordens nevroner som prosjekt til hjernen.
Under baseline forhold, nociceptive sensorisk nevrons vil ikke fyre før en relativt høy terskel er nådd. Analysene som beskrives her tillate undersøkeren å kvantifisere baseline atferdsmessige responser eller formodentlig det sensibilisering som følger følgende vevsskade. Hver analyse provoserer forskjellige, men beslektede motorisk atferdsmessige reaksjoner på skadelige termiske stimuli og tillater forskeren å visualisere og kvantifisere ulike aspekter ved termisk nociception i Drosophila larver. Analysene kan brukes til larver av ønskede genotyper eller larver hevet under ulike miljøforhold som kan påvirke nociception. Siden termisk nociception er konservert over arter, vil funnene sanket fra genetisk disseksjon i Drosophila sannsynlig informere vår forståelse av termisk nociception i andre arter, inkludert virveldyr.
Analysene beskrevet her kan brukes til kvalitativt og kvantitativt vurdere larver av ulike genotyper for respons til helsefarlige termiske stimuli. En viktig funksjon i varmen sonden analysen er at stimulus gis bare på et enkelt locus. Dette fører antakelig til avfyring av bare en liten undergruppe av klasse IV nevroner-de i segmentet kontaktet av sonden og kanskje de i umiddelbart tilstøtende segmenter 11. På grunn av den lokale stimulering, etterligner varmen sonden analysen felles sensoriske opplevelsen av å oppdage en skadelig stimulus som er lokalisert til et bestemt organ region, for eksempel en hånd å kontakte en varm ovn. En ulempe med varmen sonden analysen er at det har noen bruker-til-bruker-variasjonen som kan sannsynligvis tilskrives tre forhold: i) trykket som brukeren anvender sonde til larve, ii) den nøyaktige plasseringen av sonden på larve i forhold til de underliggende nociceptive nevroner, og iii) det nøyaktige Angle hvor sonden kontakt med overflaten av larven.
Vi tidligere rapporterte en kvantitativ strategi å kategorisere larver i ikke-respondere, langsomme respondere, og raske respondenter basert på deres uttak ventetid til en gitt temperatur ett. Her rapporterer vi på larvenes respons til enda høyere temperaturer. Interessant, finner vi at det er et tak for å larver termiske nociceptive svar og at dette taket ligger mellom 52 og 54 ° C. Dette kan indikere at larvene ikke har en forbigående reseptor potensial (TRP) kanal stand gating ved temperaturer høyere enn 52 ° C. Alternativt kan det tyde på at nervecellene eller muskler som brukes til å initiere eller gjennomføre motorisk respons bli skadet før de kan selv fungere i motvilje tilbaketrekning. Vi rapporterer også en annen analyse av amplituden til uttak respons-hjelp av enten antall ruller som en indikator på "robusthet" av responsen. Naivt, enforventer at disse parametrene ville øke med økende temperatur eller tid på stimulering. Overraskende, finner vi at dette ikke er tilfelle. Larver stimulert for en lengre tid ved en temperatur på den lave enden av skadelige området (42 ° C) viser flere ruller og mer tid brukt rullende enn larver probed ved høyere temperaturer (48-52 ° C). Dette tyder på at innen den skadelige temperaturen vinduet er det først og fremst varigheten av eksponering som bestemmer amplituden av responsen. Siden larver utsettes for svært skadelige temperaturer (48-52 ° C) reagerer på gjennomsnittlig svært raskt, de ikke viser så mange ruller som larver utsettes for en mindre skadelig temperatur for en lengre tidsperiode. Analysen av responsen amplitude rapporteres her tilfører en ny kvantitativ dimensjon langs hvilke ulike genotyper eller miljømessige manipulasjoner kan sammenlignes.
En viktig funksjon i varmen plate analysen er at det innebærer en global eksponering mot skadeligevarme. Som sådan er det mer beslektet med dyret sitte i en oppvarming kittel enn berøre en varm ovn. Selv om det er ikke klart når en larve kan oppleve en globalt skadelige stimuli i naturen, i lab de atferdsmessige reaksjoner på dette global eksponering er mer komplekse enn de som ble observert ved lokal stimulering. En styrke på varmen plate analysen, også bemerket av andre 3, er at det har lite bruker-til-bruker-variabilitet siden berøre larven er ikke en del av protokollen. Den eneste betydelige avviket synes å være i definere når hver atferd starter og dette kan minimeres ved gjentatt visning / fortrolighet. En interessant forskjell mellom de analysene er de temperaturene der de aversive atferd begynne. Disse er mye lavere i varmen plate analysen enn med varmen sonde. Den foreløpige oppførsel utstilt av larver kontaktet med varme sonden (hode og hale høyning) kan være en korrelerer av hodet thrash observert på ~ 27 ° C i varmen Plate-analysen. Det er mulig at dette svaret reflekterer "ubehag" mer enn "smerte". Vi har ikke observert en korrelere med pisking, beslag, og lammelse selv ved høy (opp til 48 ° C) temperaturer i sonden analysen og det kan være at en kritisk masse av sensorisk neuron skyte fra mer enn én region av kroppen er nødvendig for å bringe på disse atferd. Interessant nok er de beslag og lammelser atferd observert ved temperaturer (~ 34 – 37 ° C) under bunnen av nociceptive terskelen observert med varmen sonden indikerer at globalt stimulering kan innebære oppsummering av nevrale responser som er utilstrekkelig til å utløse atferd med lokale anvendelsen av varmen sonde. At disse temperaturene er faktisk oppfattes som skadedyr til larvene er støttet av den observasjon at larver som begynner lammelse atferd, og deretter lov til å utvinne på utlegger mat ikke i de fleste tilfeller overlever (figur 5C). Videre støtter argumentet om at varmen plspiste analysen leser ut nociceptive responser er det faktum at blokkering synaptisk overføring i kjente nociceptive sensoriske nevroner øker ventetiden for de fleste av de observerte atferd (figur 6). Observasjonen om at det er ingen økning i ventetiden for den høyere temperaturen pisking oppførsel tyder på at andre sensoriske nevroner som ikke uttrykker MD-Gal4 kan være nødvendig for denne atferden.
I sum, begge analysene innebære å utsette et individ larve til en skadelig termisk stimulans av definerte temperatur – den varme spissen på en liten metall sonde i den lokale analysen og innlevelse i en dråpe raskt varme vann i den globale analysen. Atferdsmessige reaksjoner fra Drosophila larver av varierende genetiske bakgrunn og / eller utsatt for varierende miljøforhold (for eksempel pluss eller minus vevsskade), kan studeres og kvantifiseres ved hjelp av disse prøvene. Til syvende og sist vil resultatene fra disse analysene hjelpe oss å bedre forstå genetiske nettverk styrer NOCiception i Drosophila og andre relaterte arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Christian Landry for varme probe design, Daniel Babcock for utvikling av larvenes varme sonden analysen, Sean Sweeney for å foreslå varmen plate analysen, den Bloomington Drosophila Stock Center for fluefiskere bestander, og Galko lab medlemmer for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01 NS069828 til MJG og en NIH MARC U-STAR Training Grant (T34GM079088 til University of Houston-Downtown Scholars Academy) for mindretallet tilgang til forskning karrierer (AVG).
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Thermal Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Contact information can be provided on request |
Dry Bath Incubator | Fisher Scientific | 11-718 | 1 solid heating block and 1 heating block with 16mm wells |
Leica DFC290 12v/400mA Color camera |
Leica Microsystems | 12730080 | Any equivalent camera will do. |
Leica MZ6 microscope | Leica Microsystems | Part number for MZ6 zoom body (optics carrier) is 10445614 | |
Schott Ace Modulamp Unit | Schott North America, Inc. | A20500 | |
Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
Thermal Control Unit | TSCI corp. | Custom Built | Details can be provided on request |
Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | Any equivalent microscope will do. |
Forceps | FST | FS-1670 | |
1mm mesh | Genesee Scientific | 57-101 | |
Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | |
UV crosslinker | Fisher Scientific | 1199289 | |
Coplin Jars | Fisher Scientific | 08-816 | |
10ml beaker | Fisher Scientific | 02-540C | |
Diethyl ether | Fisher Scientific | E138-500 | |
35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | We have not tested alternative dishes. |
Glass Microscope Slide | Corning | 26003 | |
Thermocouple | Omega Engineering, Inc. | HH802U | |
Piece of vinyl | Office Depot | 480009 | |
Microcentrifuge tube | Denville Scientific Inc. | C-2170 |