Innan du börjar Odla önskade fly kulturer. Förvara flaskorna uncrowded (ca 30 flugor per 50 ml flaska). Låt flugorna lägga ägg endast en dag i varje flaska. Detta kommer att ge larverna tillräckligt med livsmedel och låta dem komma maximal storlek innan krypa ut ur maten. Förvara injektionsflaskorna i lämplig temperatur tills tredje stadiet larver börjar vandra på flaskan väggen. Framställa en ny mald av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och PBT (0,1% Tween i PBS). Hålla 10 ml PBS på is. Förbered 1-5 ml färsk fixativ (4% formaldehyd i PBT) och hålla den på is. Vi använder flaska 37-38% formaldehyd som en stamlösning. 1. Dissektion och fixering av tredje stadiets larver Välj ett vandrande tredje stadiet larven från flaskan väggen och placera den i en 50 ^ droppe iskall PBS på en Sylgard dissekering platta (gjord av Sylgard 184 silikonelastomer kit, DOW Corning Corporation ivävnadsodlingsskål). Håll larven, rygg uppåt, nära munnen krokarna, med fina pincett (Dumont # 5 tång), och hålla en insekt stift (minutien, 0,1 mm, rostfritt stål) genom larven hjärna. Ta den bakre änden av larven med pincetten, dra försiktigt och sträcka larven försiktigt på längden. Stick en insekt pin mellan de två bakre spiracles. Med Spring sax klippa två horisontella snitt i kroppen väggen (vinkelrätt mot den främre-bakre axeln), nära de främre och bakre ben. Använda våren saxen skär larvkroppen väggen längs ryggens mittlinje från främre till bakre snittet. Ta bort inre organ (tarmar, spottkörtlar, malpighian tubuli etc.) och trakea med fin pincett. Tvätta försiktigt en gång eller två gånger med PBS. Ta de två flikarna kroppen vägg med pincett, sträck ut dem och nåla dem till plattan med två insekter ha varje sida. Ta bort PBS och tillsätt 50 | il av fixeringslösning (4% formaldehyd i PBT). Inkubera 20 minuter vid rumstemperatur. Ta bort fixativ. Tvätta två gånger med PBS. Dra ut insekter stiften. Med Spring sax klippa larver huvud och svans lämnar en rektangulär filé. Överföra den fasta vävnaden till en kyld Eppendorf-rör med PBS. När en tillräcklig antalet larver är fasta kan en fortsätta direkt till antikroppsfärgning. Om omedelbar färgning inte önskas, bör det fasta larver tvättas 3 gånger, 5 min vardera, med 95% etanol och lagrades i 95% etanol vid -20 ° C. 2. Dissektion och fixering av puppor Del I Sköta flaskorna som för larver fixering, tills tredje stadiet larver börjar pupariate. Undersök flaskorna varje timme och Mark larver som har pupariated. Låt den markerade puppor att utveckla 30-40 timmar vid 24 ° C eller 24-27 timmar vid 29 ° C. Med fin pincett plockar 20-30 puppor av the lämplig ålder och lägg dem i en mörk porslin med flera bra dissekera skålen. Var noga med att inte skada vävnader av intresse. Extrahera puppor från puppa fallet. Börja med att skala bort kapseln och fortsätta tills puppan är gratis. Sätt puppan till en fylld bra med PBT. Fortsätta att extrahera all puppor. Åtgärder 2,4-2,6 bör ske i små satser av fem puppor åt gången. Placera fem puppor på en plan yta mellan brunnarna i dissekera skålen. Användning av en mikro dissektion kniv skär spetsen av huvudet och den bakre spetsen på magen (alternativt är det möjligt att använda två par pincetter för att riva hål vid båda ändarna av puppor). Hålla puppa på plats med användning av fin pincett och använda en 1 ml spruta för att tvätta ut de inre organen hos puppa, genom att injicera PBT genom den främre öppningen. Tvätta det dissekterade puppan kortfattat genom att doppa den i en fylld väl med PBS och flytta den till den kalla fixativ i en Eppendorf-rör förvarades på is. Inkubera över natten (ON) vid 4 ° C. Del II Kasta fixativ och tvätta puppor tre gånger, 5 minuter vardera, med PBT. Håll tvättade puppor på is. Fyll två brunnar i dissekera skålen med PBT. Användning av en polyeten Pasteurpipett överföring flera puppor till en av brunnarna. Flytta en puppa i taget i den andra brunnen. Med hjälp av två par vassa tång med perfekt linje tips, dra av den genomskinliga puppa kutikula av vingen: säkra puppan till botten av brunnen med hjälp av någon pincett, och försiktigt riva nagelbanden med den andra pincett. När nagelbanden slits, dra den från vingen. Var noga med att inte koppla bort vingen från puppa. Efter peeling bort nagelbanden från vingen bladet fortsätter peeling hinnan av vingen gångjärnet (där vingen Chos finns). Efter avskalning av vingen ytterhud, kan man försöka dra av benet ytterhud på ett liknande sätt.Många ben är sannolikt att förloras i processen, men trots den låga avkastningen, är detta steg rekommenderas starkt eftersom det i hög grad förbättrar färgningen av benet Chos. De Chos av haltere och buken kan visualiseras utan ytterligare dra bort nagelbanden. Placera "skalad" puppa i en Eppendorf-rör fyllt med metanol och hålls vid rumstemperatur. Fortsätt skala bort nagelbanden av alla puppor, och lägga till dem i samma rör. Minst 10 snyggt skalade puppor ska samlas in för varje färgning. Avlägsna metanolen och tvätta tre gånger, 5 min vardera, med 95% etanol. Fast puppor kan hållas under långa perioder i 95% etanol vid -20 ° C. 3. Immunfärgning av larver och puppor Tvätta det fasta vävnaden med PBT tre gånger, 30 minuter vardera, vid rumstemperatur. Larver kan tvättas med försiktig skakning på en roterande platta. Puppor tvättas utan att skaka. Byt PBT med blockerande buffert (PBT + 5% normal getserum) och inkubera under vid 4 ° C. Avlägsna den blockerande bufferten och inkubera med primära antikroppar (utspädd i blockeringsbuffert) PÅ vid 4 ° C. Tvätta fyra gånger med PBT såsom beskrivs i steg 3.1. Avlägsna PBT och inkubera med sekundära antikroppar (utspädd i blockeringsbuffert) PÅ vid 4 ° C. Tvätta två gånger med PBT och en gång med PBS såsom beskrivs i steg 3.1. Byt PBS med monteringsmedium (Dako Fluorescent Mounting Medium (Dako Cytomation, Glostrup, Danmark) och inkubera vid 4 ° C på. 4. Montering av larver Larver är monterade på ett objektglas i en droppe montering media med sin nagelband nedåt och kroppen väggen muskler uppåt. Sätt en liten droppe monteringsmedium på en ren täckglas och använda den för att täcka beredningen. Sätt inte något tryck på den monterade larver. 5. Montering av puppor Framställa två objektglasmed en droppe monteringsmedium, en för dissektion och den andra för montering. Sätt flera puppor på en av bilderna. Med Spring saxar bort huvudet och den bakre delen av buken. Separera den dorsala delen av bröstkorgen från den ventrala halv genom att skära mellan vingarna och benen. Placera de dissekerade kroppsdelar av puppan på den andra mikroskop i en droppe monteringslösning. Se till att vingar och ben sträcks ut och försöka minimera överliggande av vävnader så mycket som möjligt. Placera en droppe montering medium på ett täckglas och placera den över provet. Tryck inte på den monterade provet. 6. Representativa resultat Ett exempel på immuno-färgade chos av tredje instar larver visas i figur 1. Detta exempel visar en snyggt sträckt abdominal segment varav sju av de åtta Chos är klart synliga. Nervceller är labELED med MAb22C10 (1:20, som erhållits från Developmental Studies Hybridoma Bank vid universitetet i Iowa), är den gemensamma jordbrukspolitiken, ligament, Cap-fastsättning och ligament celler bilagor märkta med anti-αTub85E (1:10, Klein et al. 2010). Sekundära antikroppar för fluorescerande färgning var Cy3, Cy5 eller-konjugerad anti-mouse/rabbit (1:200, Jackson Immunoresearch Laboratories). Prover visas med konfokalmikroskopi (LSM 510, Zeiss). Ett kluster av vingen chos vid den ventrala radiella venen hos en 35 h gammal puppa visas i figur 2. Figur 1 (A) Schematisk illustration av de sex celltyper som utgör en enda kanal organ. Locket fastsättning (CA), locket (C), scolopale (S), neuron (N), ligament (L) och ligament fastsättning (LA ). Den LCh5 organ, där fem Chos är grupperade, är utsträckt över gruppen av laterala tvärgående musklerna (LT1-4). Den laterala longitudinella muskeln (LL1), ventrala längsgående muskler (VL1-4) och laterala sneda ögonmuskeln (LO1) visas också. Senor celler visas som bruna sfärer (från Klein et al., 2010). (B) En abdominal del av en tredje stadiet larv ses på en 10X förstoring. Sju av de åtta Chos närvarande i varje buken segment är uppenbara: fem laterala organ som tillsammans utgör pentascolopidial organ (LCh5), en enda lateral organ (LCh1) och en av två ventrala Chos (VChB). Neuronerna (n) av de chos är märkta med den neuronala markör MAb 22C10 (röd). Ligamentet (L), locket (C) och cellerna fäste (LA, CA) är märkta med anti-αTub-85E (blå). Huvudskruvarna och ligament celler är dessutom märkas med en CHO-specifik GFP rapportörgen härbärgerande en reglerande elementet från dei lokus (Nachman et al, opublicerade data). Figur 2. </sTrong> De vinge chordotonal organen vid ventrala radiella venen ses vid 40X förstoring. De neuroner (N) är märkta med neuronala markör 22C10 (röda, B). Ligamentet (L) och locket (C) celler co-märktes med anti-αTub85E antikroppar (Blue, C) och en CHO-specifika GFP rapportörgen transgenen (Nachman et al, opublicerade data).