High-throughput eiwit expressie Generator Met behulp van een Microfluïdische Platform
Summary
We een microfluïdische benadering voor de expressie van eiwit arrays. De inrichting bestaat uit duizenden reactiekamers gecontroleerd door micro-mechanische kleppen. De microfluïdische apparaat is gekoppeld aan een microarray-gedrukte gen bibliotheek. Deze genen worden vervolgens getranscribeerd en getranslateerd on-chip, resulterend in een eiwit array klaar voor experimenteel gebruik.
Abstract
Snel toenemende velden, zoals systeembiologie, vereisen de ontwikkeling en implementatie van nieuwe technologieën, waardoor high-throughput en high-fidelity metingen van grote systemen. Microfluidics belooft aan veel van deze vereisten, zoals het uitvoeren van high-throughput screening experimenten on-chip, omvattende biochemische, biofysische en cel-gebaseerde testen 1. Sinds de vroege dagen van microfluidics apparaten is dit gebied sterk ontwikkeld, wat leidt tot de ontwikkeling van microfluïdische grootschalige integratie 2,3. Deze technologie maakt de integratie van duizenden van micromechanische kleppen op een apparaat met een post-sized footprint (figuur 1). We hebben een high-throughput microfluïdische platform voor het genereren van in vitro expressie van eiwit arrays (Figuur 2) naam PING (eiwitinteractienetwerk Generator). Deze arrays kan dienen als een sjabloon voor veel experimentenzoals eiwit-eiwit 4, eiwit-RNA 5 of eiwit-DNA interacties 6.
Het apparaat bestaat uit duizenden reactiekamers, die individueel worden geprogrammeerd met behulp van een microarrayer. Uitlijning van de gedrukte microarrays microfluidics apparaten programma elke kamer met een plek tegelijkertijd potentiële verontreiniging of kruisreactiviteit Bovendien genereren microarrays met behulp van standaard technieken microarray spotten is ook zeer modulair, waardoor het rangschikken van eiwitten 7, 8 DNA, kleine moleculen en zelfs colloïdale suspensies. De potentiële impact van microfluidics op de biologische wetenschappen is aanzienlijk. Een aantal microfluidics gebaseerde assays zijn reeds nieuwe inzichten in de structuur en functie van biologische systemen en het gebied van microfluidics blijft biologie beïnvloeden.
Protocol
Discussion
In dit artikel presenteren we een methode voor het genereren eiwitseries in high-throughput met behulp van een microfluïdische platform. De array generatie is gebaseerd op microarray afdrukken van DNA templates en in vitro eiwitexpressie van DNA in de microfluïdische apparaat.
Onze nieuwe microfluïdische platform heeft een aantal belangrijke voordelen ten opzichte van de thans gebruikte methoden, waardoor het een veelbelovende en algemeen instrument voor proteomics. Een voordeel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door Marie Curie internationale re-integratie subsidie.
Materials
| Reagent/Equipment | Company | Catalogue number |
| PDMS- SYLGARD 184 | Dow Corning USA | ESSEX-DC |
| Chlorotrimethylsilane (TMCS | Sigma-Aldrich | C72854 |
| Epoxy coated glass substrates | CEL Associates USA | VEPO-25C |
| Poly ethylene glycole (PEG) | Sigma-Aldrich | 81260 |
| D-trehalose dihydrate | Sigma-Aldrich | T9531 |
| Biotinylated-BSA | Pierce | PIR-29130 |
| Neutravidin | Pierce | 31050 |
| penta-His-biotin | Qiagen | 34440 |
| Hepes | Biological Industries | 03-025-1B |
| TNT-T7 | Promega | L5540 |
| C-myc Cy3 antibody | Sigma -Aldrich | |
| Control box | Stanford Microfluidics Foundry | |
| Mold | Stanford Microfluidics Foundry | |
| Pin | New England Small Tubes Corporation | |
| Tygon microbore tubing | Tygon | S-54-HL |
| Microarrayer | Bio Robotics | MicroGrid 610 |
| Silicone pins | Parallel Synthesis | SMT-S75 |
References
- Maerkl, S. J. Integration column: Microfluidic high-throughput screening. Integrative biology quantitative biosciences from nano to macro. 1, 19-29 (2009).
- Hong, J. W., Quake, S. R. Integrated nanoliter systems. Nature. 21, 1179-1183 (2003).
- Unger, M. A Monolithic Microfabricated Valves and Pumps by Multilayer Soft Lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
- Gerber, D., Maerkl, S. J., Quake, S. R. An in vitro microfluidic approach to generating protein-interaction networks. Nature. 6, 71-74 (2009).
- Einav, S. Discovery of a hepatitis C target and its pharmacological inhibitors by microfluidic affinity analysis. Nature. 26, 1019-1027 (2008).
- Fordyce, P. M. De novo identification and biophysical characterization of transcription-factor binding sites with microfluidic affinity analysis. Nature Biotechnology. 28, 962-967 (2010).
- Zhu, H. Global analysis of protein activities using proteome chips. Science (New York, N.Y.). 293, 2101-2105 (2001).
- Ramachandran, N. Self-assembling protein microarrays. Science (New York, N.Y.). 305, 86-90 (2004).
- Zhong, J. F. A microfluidic processor for gene expression profiling of single human embryonic stem cells. Lab on a chip. 8, 68-74 (2008).
- Kusnezow, W., Hoheisel, J. D. Solid supports for microarray immunoassays. Journal of molecular recognition JMR. 16, 165-176 (2003).
- Lundin, M., Monne, M., Widell, A., Von Heijne, G., Persson, M. A. A. Topology of the membrane-associated hepatitis C virus protein NS4B. Journal of virology. 77, 5428 (2003).
