कृत्रिम थूक मध्यम का प्रयोग खिलाफ टेस्ट एंटीबायोटिक प्रभावकारिता<em> Pseudomonas aeruginosa</em> सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़े अधिक प्रासंगिक शर्तों में

Summary

वर्तमान नैदानिक ​​रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परीक्षण पोषक तत्व अमीर, एरोबिक परिस्थितियों में आइसोलेट्स planktonic विकास पर निर्भर करता है. यहाँ, हम एक वैकल्पिक कृत्रिम थूक के लिए दोनों एरोबिक और microaerophilic सिस्टिक फाइब्रोसिस फेफड़ों के प्रतिनिधि की शर्तों के तहत Pseudomonas aeruginosa biofilms के रोगाणुरोधी संवेदनशीलता का अध्ययन मध्यम रोजगार.

Abstract

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic¹. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic². The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests³.

Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence^4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.

An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a >128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.

The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods³. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms^{7, 8}. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung⁹ . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa² and affect antibiotic susceptibility¹⁰. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Protocol

1. कृत्रिम थूक मध्यम की तैयारी (एएसएम) मछली शुक्राणु से 250 मिलीलीटर बाँझ पानी के लिए कई घंटे की अवधि में 4 जी डीएनए बहुत धीरे धीरे जोड़ें. डीएनए कई घंटे लगते हैं पूरी तरह से भंग है और कमरे के तापमान पर रातोंरात उभारा जा सकता है. सुअर का (प्रकार द्वितीय) के लिए धीरे से 250 मिलीलीटर बाँझ पानी पेट से 5 ग्राम mucin जोड़ें जब तक mucin पूरी तरह से भंग कर दिया है. समाधान 4 में रात भर हड़कंप मच गया डिग्री सेल्सियस 0.25 हर आवश्यक और गैर आवश्यक अमीनो एसिड एल के जी भंग, एल tyrosine और एल सिस्टीन के अपवाद के साथ 100 मिलीलीटर बाँझ पानी में. 0.5 एम पोटेशियम हीड्राकसीड (एम आर 56.11 छ / mol) एल tyrosine के 25 मिलीलीटर की बाँझ पानी में और 0.25 ग्राम की 25 मिलीलीटर में 0.25 एल सिस्टीन जी भंग. 5.9 मिलीग्राम diethylenetriaminepentaacetic एसिड (DTPA), 5 ग्राम NaCl और 2.2 जी बाँझ पानी की 100 मिलीलीटर में KCl की भंग. 1 लीटर की बोतल में डीएनए, mucin, एल अमीनो एसिड, DTPA, NaCl और KCl का मिश्रण. अंडे की जर्दी ई के 5 मिलीलीटर जोड़ेंmulsion और बाँझ पानी के साथ लगभग 850 मिलीलीटर के लिए भरण. और बाँझ पानी के साथ मात्रा 1 लीटर लाने, 6.9 पीएच 1 एम Tris (एम 121.14 आर 8.5 पीएच) के साथ समायोजित करें. और .22 माइक्रोन और 45 मिमी की गर्दन ध्यान में लीन होना आकार के साथ एक ME 2 डायाफ्राम वैक्यूम पंप Vacuubrand Millipore और Steritop से फिल्टर इकाइयों का उपयोग कर, क्रमशः निस्पंदन द्वारा ASM जीवाणुरहित. प्रत्येक Steritop फिल्टर इकाई किया जा सकता है तुरंत फिर से इस्तेमाल किया तीन बार, तथापि, फिल्टर करने के लिए दो बार बाँझ पानी के साथ फिर से उपयोग करने से पहले rinsed होना चाहिए. निस्पंदन प्रक्रिया धीमी है और 2 दिन पर प्रदर्शन किया जा सकता है. एएसएम के अन्य संस्करणों को विकसित किया गया है कि एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा 11 तथापि छानने का काम संभव दवा बातचीत के कारण के बजाय का उपयोग करें, हम इस विशेष आवेदन के लिए विधि की सिफारिश नहीं है. अनफ़िल्टर्ड और एएसएम फ़िल्टर अंधेरे में डिग्री सेल्सियस 4 में संग्रहित किया जाना चाहिए. ताजा एएसएम का उपयोग की सिफारिश की है लेकिन, यह एक महीने की एक अधिकतम के लिए इन शर्तों के तहत रखा जा सकता है. </lमैं> 2. बिना डंठल planktonic सेल न्यूनतम मेटाबोलिक निरोधात्मक एकाग्रता (PSMIC) का निर्धारण कम से कम चयापचय निरोधात्मक (PSMIC) 15 planktonically बड़े हो पी. के लिए एकाग्रता मूल्यों का निर्धारण aeruginosa आइसोलेट्स, microdilution विधि, किया जाना चाहिए के रूप में रोगाणुरोधी रसायन चिकित्सा BSAC के लिए 12 ब्रिटिश सोसायटी के दिशा निर्देशों में वर्णित है. एंटीबायोटिक पसंद की, इस मामले tobramycin सल्फेट में क्रमानुसार 96 अच्छी तरह से microtitre एंटीबायोटिक सांद्रता का एक उचित सीमा प्रदान की थाली में (पौंड) Luria, Bertani के मध्यम में पतला. पी. की रात संस्कृतियों पतला (0.01 ±) 0.05 के एक आयुध डिपो 600 पौंड में aeruginosa और 96 अच्छी तरह microtitre क्रमानुसार पतला एंटीबायोटिक की 100 μl युक्त थाली के कुओं को 100 μl संस्करणों जोड़ें. 0.5 μg / मिलीलीटर इस मामले में, tobramycin सल्फेट की अंतिम सांद्रता 512 के बीच रहा. आठ प्रत्येक antib की प्रतिकृतिiotic एकाग्रता का प्रदर्शन किया जाना चाहिए. एक अलग के लिए नकारात्मक नियंत्रण कुओं स्थापना की जानी चाहिए, जिसमें कोई एंटीबायोटिक जोड़ा जाता है. इसके अलावा, आठ कुओं बहाव के विश्लेषण के दौरान एक रिक्त (2.6 धारा) के रूप में इस्तेमाल के लिए केवल लेग शामिल करना चाहिए. 2 दिन एरोबिक या microaerophilic (5% 2 हे, 10% सीओ 2, और 85% N 2) की शर्तों के तहत मिलाते हुए बिना 37 ° C – 1 के लिए 96 ही microtitre प्लेटें सेते हैं. Microaerophilic शर्तों CampyGen बड़े anaerobic जार में गैस पीढ़ी पैक का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं. ऊष्मायन के बाद, बैक्टीरियल वृद्धि Fluostar ओमेगा से microplate पाठक और मार्स डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 600 एनएम के तरंग दैर्ध्य में हर अच्छी तरह से में बैक्टीरियल संस्कृति के absorbance के मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है. एंटीबायोटिक का इलाज planktonic संस्कृतियों (एक एंटीबायोटिक इलाज planktonic कोशिकाओं) और नकारात्मक (एक नकारात्मक नियंत्रण) नियंत्रण से अवशोषण से अवशोषण घटाना द्वारा सही किया जाना चाहिएआयन पृष्ठभूमि absorbance के कुओं युक्त केवल पौंड (एक रिक्त) से प्राप्त की. व्यवहार्यता का प्रतिशत निषेध बाद में (एक एंटीबायोटिक इलाज planktonic कोशिकाओं का मतलब / एक नकारात्मक नियंत्रण का मतलब है) x 100% के रूप में गणना की है. 90 PSMIC एंटीबायोटिक planktonic बैक्टीरियल वृद्धि का 90% निषेध के कारण एकाग्रता के रूप में परिभाषित किया गया है. पसंद की एंटीबायोटिक, 0.02% की 10 μl (v / v) resazurin (आसुत पानी में पतला) एक अच्छी तरह से जोड़ा जाता है और प्लेट एरोबिक शर्तों के तहत 1 के लिए incubated हैं के साथ उपचार के बाद बैक्टीरिया व्यवहार्यता का निर्धारण 2 घंटे 37 ° सी, जबकि 150 rpm पर मिलाते हुए. व्यवहार्य कोशिकाओं गुलाबी फ्लोरोसेंट resorufin प्रपत्र नीले resazurin डाई कम हो जाएगा. Resazurin साथ ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से 540 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और एक Fluostar ओमेगा microplate रीडर में 590 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन का उपयोग करने के प्रतिदीप्ति की निगरानी. डेटा के रूप में वर्णित किया जा विश्लेषण किया जाना चाहिएकम. 3. Biofilm बिना डंठल सेल न्यूनतम निरोधात्मक एकाग्रता का निर्धारण (BSMIC) पी. की ओवरनाइट संस्कृतियों aeruginosa पौंड (इस मामले में, पी. aeruginosa के 15 आइसोलेट्स का उपयोग किया जाता है) में 0.05 की एक 600 आयुध डिपो (0.01 ±), ताजा एएसएम में तो आगे से पतला 1:100 के लिए पतला होना चाहिए (कुल मात्रा 1.8 मिलीग्राम). पतला संस्कृतियों (1.8 मिलीग्राम) 24 अच्छी तरह से एक ऊतक संस्कृति प्लेट इलाज की हर अच्छी तरह से करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए. तीन कुओं बहाव के विश्लेषण के दौरान एक रिक्त (3.9 धारा) के रूप में उपयोग के लिए केवल ASM शामिल करना चाहिए. 3 दिनों के लिए एरोबिक या microaerophilic शर्तों के तहत से प्रयोगशाला parafilm और सेते हैं साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें 37 ° C पर, सुरक्षित, जबकि 75 rpm पर मिलाते हुए. Microaerophilic शर्तों बड़े अनेरोबिक जार में CampyGen गैस पीढ़ी पैक का उपयोग कर प्राप्त किया जाना चाहिए. पसंद की एंटीबायोटिक पतला करने के लिए, इस मामले में tobramycin सल्फेट में ताजा में एक उपयुक्त एकाग्रता सीमा प्रदानएएसएम. 1 μg / एमएल – इस उदाहरण में, अंतिम सांद्रता 512 के बीच लेकर. एंटीबायोटिक का प्रत्येक एकाग्रता जोड़ें, 200 μl की मात्रा में 24 अच्छी तरह से प्लेटों के उचित कुओं. चार प्रत्येक एंटीबायोटिक एकाग्रता की प्रतिकृति किया जाना चाहिए. पसंद की एंटीबायोटिक के लिए संपर्क नहीं biofilms एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया. 37 पर एक और 24 घंटे के लिए एरोबिक या microaerophilic शर्तों डिग्री सेल्सियस के तहत से प्रयोगशाला parafilm और सेते हैं साथ 24 अच्छी तरह प्लेटें सुरक्षित, जबकि 75 rpm पर मिलाते हुए. पसंद की एंटीबायोटिक की उपस्थिति में ऊष्मायन के बाद, 100 के 100 मिलीग्राम / एमएल cellulase (0.05 एम साइट्रेट बफर में पतला μl [9.6 Citrate.H छ / एल 2 में पानी और पीएच 0 NaOH के साथ 4.6] का उपयोग जीवाणु biofilms बाधित ) और 37 ° C पर एरोबिक शर्तों के तहत 24 अच्छी तरह प्लेटें, सेते हैं, जबकि 1 घंटे के लिए 150 rpm पर मिलाते हुए. यदि आवश्यक हो, biofilms और इस स्तर पर किया जा सकता है मैनुअल pipetting द्वारा बाधित है. चयापचय गतिविधियों का निर्धारणबैक्टीरियल कोशिकाओं बाधित biofilms से जारी की, 0.02% की 100 μl (v / v) resazurin (आसुत पानी में पतला) 24 अच्छी तरह से प्लेटों के प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ा जाना चाहिए और 1 के लिए incubated रहे 2 घंटे 37 डिग्री सेल्सियस पर है, जबकि 150 rpm पर मिलाते हुए. Resazurin साथ ऊष्मायन के बाद, प्रत्येक अच्छी तरह से 540 एनएम के एक उत्तेजना तरंगदैर्ध्य और एक Fluostar ओमेगा से microplate पाठक और मार्स डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर में 590 एनएम के तरंग दैर्ध्य उत्सर्जन का उपयोग करने के प्रतिदीप्ति उपाय. एंटीबायोटिक इलाज (एफ biofilms एंटीबायोटिक का इलाज) biofilms और नकारात्मक नियंत्रण (एफ नकारात्मक नियंत्रण) से प्रतिदीप्ति से प्रतिदीप्ति पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति एएसएम युक्त कुओं से प्राप्त की घटाव द्वारा सही किया जाना चाहिए केवल (एफ रिक्त). व्यवहार्यता का प्रतिशत निषेध बाद में (एफ एंटीबायोटिक इलाज biofilms के मतलब / एफ नकारात्मक नियंत्रण का मतलब है) x 100% के रूप में गणना की है. BSMIC 90 antibio के रूप में परिभाषित किया गया हैघरेलू एकाग्रता चयापचय गतिविधि की 90% निषेध हो सकता है. 4. प्रतिनिधि परिणाम ASM biofilm गठन छोटी मात्रा में (2 मिलीग्राम) में संभव है और biofilms बनाने के लिए पूरी तरह से 3 दिनों के भीतर (चित्रा 1 ए) का गठन कर रहे हैं. यह कड़ाई से biofilm, जो बाधित करने के लिए मुश्किल होना चाहिए pipetting द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है. microcolonies बड़ा 4 मात्रा में (चित्रा 1 बी) में हो उन लोगों के लिए तुलना कर रहे हैं चित्रा 2 और planktonically एक biofilm में हो के रूप में इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवि विश्लेषण से पता चला कोशिकाओं के बीच प्रमुख अंतर से पता चलता है. Biofilm संस्कृतियों को स्पष्ट रूप से पता चलता है biofilm भीतर और कोशिकाओं व्यक्ति संरचनाओं आसपास के बाह्य मैट्रिक्स की काफी स्तर की पहचान मुश्किल है. कई अध्ययनों से संकेत मिलता है कि biofilm रोगाणुरोधी संवेदनशीलता 13 14, जीवन शैली को प्रभावित कर सकते हैं. हमारे छोटे पैमाने पर एएसएम परख देते करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैएक ही समय में एकाधिक आइसोलेट्स के लिए कई एंटीबायोटिक दवाओं के BSMIC rmine. परख की कार्यप्रवाह चित्रा 3 में दिखाया गया है. बैक्टीरिया सेल व्यवहार्यता पर एंटीबायोटिक दवाओं के प्रभाव resazurin परख का उपयोग करके मापा जा सकता है. एंटीबायोटिक दवाओं, इस मामले में tobramycin में, स्थापित biofilm के लिए जोड़ा जा सकता है और 24 घंटे के लिए incubated रहे. इस biofilm के बाद बाधित है और resazurin जोड़ा जाता है. Metabolically सक्रिय कोशिकाओं resazurin डाई गुलाबी (resorufin) के 15 से नीला (resazurin) से एक रंग परिवर्तन में जिसके परिणामस्वरूप को कम कर सकते हैं. 4A चित्रा एक उदाहरण परख से पता चलता है जो पी. aeruginosa biofilm और एक microtitre थाली में resazurin के अलावा विघटन के पहले tobramycin के विभिन्न सांद्रता के साथ incubated किया गया था. गैर फ्लोरोसेंट नीले रंग अलाभकारी कोशिकाओं को इंगित करता है, जबकि व्यवहार्य कोशिकाओं गुलाबी फ्लोरोसेंट प्रपत्र, resorufin की डाई को कम. इस SMIC तो प्रतिशत में प्रतिदीप्ति परिवर्तित द्वारा गणना किया जा सकता हैबैक्टीरियल व्यवहार्यता 4B चित्रा शेष tobramycin एकाग्रता बढ़ाने के साथ% व्यवहार्यता में परिवर्तन को दर्शाता है. 10% की व्यवहार्यता एक कट ऑफ के रूप में चुना गया था क्रम में SMIC 90 गणना. एरोबिक शर्तों के तहत, tobramycin SMIC 90 मूल्यों planktonic संस्कृतियों के उन लोगों की तुलना में एक biofilm के रूप में विकसित कोशिकाओं के लिए उच्च रहे हैं. तालिका 1 के सभी आइसोलेट्स लिए परीक्षण 90 PSMIC और 90 BSMIC में भिन्नता से पता चलता है. तालिका 2 से पता चलता है कि एरोबिक शर्तों के तहत, प्रतिरोध में एक नाटकीय tobramycin वृद्धि (2> SMIC में 32 गुना वृद्धि करने के लिए) सबसे आइसोलेट्स के लिए मनाया गया जब पौंड (planktonic मोड) के लिए तुलना में एएसएम (biofilm मोड) में उगाया. इसके अलावा, microaerophilic शर्तों के तहत बड़े हो biofilms के बीच 2 और 128 गुना वृद्धि हुई SMIC प्रदर्शन जब एरोबिक शर्तों के अधीन हो biofilms बनाने के लिए तुलना में. चित्रा1. पी. aeruginosa के एएसएम पी. में biofilm गठन aeruginosa PAO1 तनाव macroscopically दिखाई clumps (microcolonies) जब एएसएम में हो रूपों., 30 मिलीलीटर एएसएम संस्कृतियों में Biofilm पेंच टोपी कांच Duran बोतल बी, 2 मिलीलीटर एएसएम संस्कृतियों में Biofilm गठन में 7 दिनों के विकास के बाद (बड़े पैमाने पर) गठन ( छोटे पैमाने पर) 24 अच्छी तरह से योग्य polystyrene प्लेटों में 3 दिनों के विकास के बाद. चित्रा 2. एएसएम biofilms के मंदिर micrographs ए / सी मंदिर माइक्रोग्राफ, PAO1 की (एक्स +२७०००) planktonically और ASM में हो, क्रमशः, / PAO1grown planktonic की बी डी मंदिर माइक्रोग्राफ (x57, 000) और एएसएम में क्रमशः,. Planktonically बड़े हो बैक्टीरिया रातोंरात लेग शोरबा में खेती की जाती थी. Biofilms 30 मिलीलीटर एएसएम संस्कृतियों में 7 दिनों के लिए खेती की जाती थी. काले तीर biofilm के भीतर कोशिकाओं को देखें और सितारों बाह्य रिक्त स्थान के लिए देखें. स्केल सलाखों = 1माइक्रोन. चित्रा 3. एएसएम biofilm रोगाणुरोधी संवेदनशीलता परख की कार्यप्रवाह. चित्रा 4. बैक्टीरियल कोशिकाओं एंटीबायोटिक के अलग सांद्रता और शेष चयापचय गतिविधि resazurin का उपयोग करके निर्धारित किया गया था के साथ incubated रहे थे एंटीबायोटिक भावनाएँ का दृढ़ संकल्प के लिए resazurin का प्रयोग करें., नीले गैर के फ्लोरोसेंट resazurin के ऑक्सीकरण के फार्म का अलाभकारी कोशिकाओं का संकेत है और चयापचय से कम गुलाबी फ्लोरोसेंट resorufin बी. सक्रिय कोशिकाओं, प्रतिदीप्ति तीव्रता शेष बैक्टीरिया व्यवहार्यता का प्रतिशत में बदल जाता है. 10% व्यवहार्यता कटौती बंद के रूप में चुना गया था क्रम में MSMIC90 गणना लोकप्रिय देखने के लिए यहाँ क्लिक करेंप्रासंगिकता आंकड़ा. </span> खींच 90 (μg / मिलीलीटर) 1 PSMIC 90 (μg / मिलीलीटर) 1 BSMIC एरोबिक 2 microaerophilic एरोबिक 2 microaerophilic PAO1 4 4 8 512> लिवरपूल महामारी तनाव (लेस) आइसोलेट्स LESB58 21 8 64 64 128 LES400 22 32 128 8 256 LESB25 16 32 256 512 LESB55 16 64 64 512> LESB64 16 64 512> 512> LES431 22 4 8 32 512> LESB49 16 64 64 256 LES109 32 128 32 512> गैर लेस आइसोलेट्स ४९४६१ 16 32 16 512> 59,032 0.5 2 4 512> ५९०७३ 512> 512> 512> 512> ५९,०७६ 16 32 32 > <512> 27 8 16 4 512> 45 16 32 4 512> तालिका 1. Tobramycin के लिए पी. aeruginosa की संवेदनशीलता. 1 2 गुना धारावाहिक dilutions में PSMICs और BSMICs tobramycin के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया गया था 512 से लेकर 0.5 μg / एमएल (n = प्रत्येक एकाग्रता के लिए 8) और 512 – 1 μg / एमएल (n = 4 प्रत्येक के लिए एकाग्रता), क्रमशः, PSMICs मानक का उपयोग कर निर्धारित किया गया है microdilution विधि 1. 2 Microaerophilic शर्तों 5% 2 हे, 10% सीओ 2, और 85% एन 2 थे. तनाव 90 PSMIC / 90 गुना परिवर्तन एक BSMIC PSMIC एरोबिक → PSMIC microaerophilic BSMIC एरोबिक → BSMIC microaerophilic PSMIC एरोबिक → BSMIC एरोबिक Microaerophilic PSMIC → BSMIC microaerophilic PAO1 0 64> 2 128 लेस आइसोलेट्स LESB58 8 2 8 2 LES400 4 32 0.25 2 LESB25 2 2 16 16 LESB55 4 8> </td> 4 8> LESB64 4 एन डी 32> 8> LES431 2 16> 8 64> LESB49 4 4 4 4 LES109 4 16 0 > 4 गैर लेस आइसोलेट्स ४९४६१ 2 32> 0 16> 59,032 4 128> 8 256> ५९०७३ एन डी एन डी एन डी एन डी ५९,०७६ 2 16> </p> 2 16> 27 2 128> 0.5 32> 45 2 128> 0.25 16> तालिका 2 tobramycin के लिए PSMICs और BSMICs के मोड़ो परिवर्तन. 1 एन डी, नहीं निर्धारित बोल्ड में मान SMIC गुना परिवर्तनों को 10 से संकेत मिलता है.

Discussion

इस अध्ययन में हम इन विट्रो मॉडल में एक उपन्यास का इस्तेमाल एएसएम पर आधारित पी. को दोहराने के aeruginosa CF फेफड़ों ⁴ भीतर biofilm शर्तें. मॉडल को सफलतापूर्वक छोटे पैमाने पर, antimicrobial एजेंटों की उच्च throughput परीक्षण के लिए संशोधित किया गया था.

इस परख की महत्वपूर्ण कदम हैं:

1. ASM मीडिया और बनाए रखने के बाँझपन के अनुरूप तैयारी. हम लंबे समय तक में जिस तरह प्रत्येक घटक के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम हर समय हासिल करने के लिए जोड़ा जाता है अनुकूलित करने के लिए समर्पित है. एएसएम के छानने का काम धीमी गति से लेकिन वाष्पदावी विसंक्रण है, जो mucin घटक को नुकसान हो सकता है के लिए बेहतर है. हम एंटीबायोटिक दवाओं के अलावा, के रूप में ¹¹ अन्य लोगों ने सुझाव दिया की सलाह नहीं है क्योंकि यह काफी चयनात्मक दबाव, ड्राइव म्यूटेशनों लगाने, prophage lysis ¹⁶ को प्रेरित कर सकते हैं और काफी कई बैक्टीरियल जीन की अभिव्यक्ति बदल.
2. परख मात्रा ओ के अनुसार अनुकूलित किया जाना चाहिएच एएसएम इस्तेमाल किया. हिलती गति छोटे संस्करणों के लिए बढ़ रहे हैं और एक छोटे जीवन चक्र biofilm मनाया जाता है.

लघु ASM biofilm मॉडल की एक स्पष्ट आवेदन biofilm रोगाणुरोधी भावनाएँ ₍₉₀ BSMIC) के और अधिक यथार्थवादी दृढ़ संकल्प है. Anaerobic और microaerophilic niches CF फेफड़ों में मौजूद हैं और वहाँ सबूत है कि ऑक्सीजन गहरे परिपक्व ^{2 biofilms, 17 के} भीतर सीमित है. यहाँ हम दिखाना है कि 10/14 नैदानिक ​​पी. tobramycin के लिए संवेदनशीलता में एएसएम में microaerophilic शर्तों के तहत कमी – सीएफ़ रोगी sputa से aeruginosa आइसोलेट्स एक काफी (≥ 128 गुना 4) एक्ज़िबिट. इस अध्ययन के परिणाम बताते हैं कि एंटीबायोटिक दवाओं, ऐसे tobramycin के रूप में, कम पी. के खिलाफ प्रभावी हो सकता है CF फेफड़ों में संक्रमण aeruginosa से पारंपरिक संवेदनशीलता परीक्षण तरीकों ने संकेत दिया. इन परिणामों ¹⁰ biofilms के रोगाणुरोधी संवेदनशीलता पर पिछले अध्ययनों को दर्शाते हैं. छोटेassays पैमाने पर एएसएम इस तरह सार्थक एंटीबायोटिक संवेदनशीलता डेटा बेहतर चिकित्सीय फैसले को सूचित करने के लिए एक सरल उच्च throughput मंच प्रदान करते हैं. परख उसी तरह पारंपरिक है कि एक कालोनियों में एंटीबायोटिक संवेदनशीलता परीक्षण के रूप में है कि पूरी आबादी का प्रतिनिधि नहीं हो सकता है स्क्रीनिंग के लिए चुना जाता में सीमित है. हालांकि, हम मानते हैं कि (i) गैर सतह संलग्न biofilm विकास और (ii) microaerophilic शर्तों के लागू दृष्टिकोण का उपयोग कर, एक स्पष्ट विकल्प और मौजूदा तरीकों के लिए एक संभावित सुधार का प्रतिनिधित्व करता है. हम निष्कर्ष है कि इस परख पी. अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल है aeruginosa biofilm आबादी. नैदानिक ​​सेटिंग में आगे परीक्षण का पता लगाना होगा कि एंटीबायोटिक भावनाएँ biofilm से बड़े हो पी. के आधार पर aeruginosa संभावित सुधार सूक्ष्मजीवविज्ञानी और नैदानिक ​​परिणामों के साथ अलग एंटीबायोटिक विकल्प के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. क्लासिक biofilm मॉडल भी इसी तरह का उपयोग कर जांच से पता चला है कि BSMIC मूल्यों नेतृत्वएंटीबायोटिक उपचार ^5,17 के लिए विभिन्न सिफारिशों को.

विरोधी संक्रामक एजेंटों के प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए इसके अलावा, एएसएम पी. के विविधीकरण को समझने के उद्देश्य से उन लोगों के रूप में इस तरह के अध्ययन के लिए एक सस्ता, सरल और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पशु मॉडल के लिए वैकल्पिक प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है aeruginosa आबादी. हम पी. की प्राकृतिक आबादी में व्यापक विविधता है मनाया aeruginosa सीएफ़ रोगी ^{18 sputa, 19} से बरामद किया. समान प्ररूपी और genotypic विविधीकरण ⁴ एएसएम (और हमारे अप्रकाशित डेटा) में वृद्धि के दौरान देखा जा सकता है, यह CF फेफड़ों की स्थिति के इन विट्रो मॉडल में एक आकर्षक बना रही है. एएसएम मॉडल के रिश्तेदार सादगी बनाता है यह आसान डिजाइन के लिए लंबी अवधि के अनुकूलन प्रयोगों पी. पर एंटीबायोटिक दवाओं या अन्य तनाव के प्रभाव की निगरानी में उदाहरण के लिए, उद्देश्य aeruginosa जनसंख्या विचलन. इसके अलावा, अन्य बैक्टीरियल रोगज़नक़ों में उगाया जा सकता हैएएसएम. उदाहरण के लिए, Fouhy एट अल 2007. एएसएम का इस्तेमाल किया है एस द्वारा biofilm गठन का अध्ययन ²⁰ maltophillia.

Materials

Name of reagent	Company	Catalogue number
DNA from fish sperm	Sigma-Aldrich	74782
Mucin from porcine stomach, type II	Sigma-Aldrich	M2378
L-Alanine	Acros Organics	102830250
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006
L(+)-Asparagine monohydrate	Acros Organics	175271000
L(+)-Aspartic acid	Acros Organics	105041000
L-Cysteine	Sigma-Adrich	168149
L(+)-Glutamic acid	Acros Organics	156211000
L-Glutamine	Sigma-Aldrich	G3126
Glycine	Acros Organics	220911000
L-Histidine	Sigma-Adrich	H8000
L-Isoleucine	Sigma-Aldrich	I2752
L-Leucine	Sigma-Aldrich	L8000
L(+)-Lysine monohydrochloride	Acros Organics	125222500
L-Methionine	Sigma-Aldrich	M9625
L-Phenylalanine	Acros Organics	130310250
L-Proline	Sigma-Aldrich	P0380
L-Serine	Acros Organics	132660250
L-Threonine	Acros Organics	138930250
L(-)-Tryptophan	Acros Organics	140590250
L-Tyrosine	Acros Organics	140641000
L-Valine	Sigma-Aldrich	V0500
Diethylenetriaminepentaacetic acid	Sigma-Aldrich	32318
NaCl	Fisher Scientific	S/3160/60
KCl	BDH	BDH0258
KOH	BDH	BDH0262
Egg yolk emulsion	Sigma-Aldrich	17148
ME 2 diaphragm vacuum pump	Vacuubrand	696126
Steritop filters (Pore size: 0.22 μm, Neck size: 45 mm)	Millipore	SCGPT10RE
Luria-Bertani medium	Sigma	L2897
96-well microtitre plates	Sarstedt	82.1581
24-well tissue culture-treated plates	Iwaki	3820-024
CampyGen gas generation packs	Oxoid	CN0025
Microaerophilic chamber	Oxoid	HP0011
Tobramycin sulphate	Sigma-Aldrich	T1783
Cellulase, from Aspergillus niger	Sigma-Aldrich	22178
Resazurin	Sigma-Aldrich	199303
Citrate.H20	BDH	BDH0288
Fluostar omega microplate reader	BMG-Labtech	SPECTROstar Omega