Coltura e Applicazioni di bioreattore rotante Vessel parete Derivato di modelli 3D di cellule epiteliali
Summary
Un rotante sistema di coltura cellulare che consente alle cellule epiteliali di crescere in condizioni fisiologiche con conseguente 3-D formazione di aggregati cellulare viene descritto. Gli aggregati di visualizzazione generato<em> In vivo</em> Caratteristiche simili non osservata in modelli di colture convenzionali e servire come un sistema più accurato modello di organotipica per una moltitudine di ricerche scientifiche.
Abstract
Cellule e tessuti in condizioni di sperimentare il corpo ambientali che influenzano la loro architettura, le comunicazioni intercellulari e le funzioni generali. Per i modelli cellulari in coltura in vitro per simulare con precisione il tessuto di interesse, l'ambiente di crescita della cultura è un aspetto critico da considerare. Comunemente utilizzati convenzionali sistemi di coltura cellulare propagano cellule epiteliali su superfici piane bidimensionali (2-D) impermeabili. Sebbene molto sia stato appreso dai sistemi convenzionali di coltura cellulare, molti risultati non sono riproducibili in studi clinici umani o espianti di tessuto, potenzialmente a causa della mancanza di un microambiente fisiologicamente rilevante.
Qui, si descrive un sistema di coltura che supera molti dei confini delle condizioni di coltura di 2-D colture cellulari, utilizzando l'innovativo rotante parete del vaso (RWV) tecnologia bioreattore. Noi e altri hanno mostrato che organotipiche RWV derivati i modelli possono ricapitolare Structure, la funzione e autentiche risposte umane a stimoli esterni in modo simile ai tessuti umani espianti 1-6. Il bioreattore RWV è un sistema di coltura in sospensione che consente la crescita di cellule epiteliali in condizioni fisiologiche bassa fluido di taglio. I bioreattori sono disponibili in due diversi formati, ad alta aspetto recipiente rotante (Harv) o una lenta rotazione vaso laterale (STLV), in cui si distinguono per la loro fonte aerazione. Le cellule epiteliali vengono aggiunti al bioreattore di scelta in combinazione con porosi, collagene perle rivestite microveicolo (Figura 1A). Le cellule utilizzano le perline come una crescita ponteggio durante la caduta libera costante nel bioreattore (figura 1B). Il microambiente fornito dal bioreattore permette alle cellule di formare aggregati tridimensionali (3-D) mostrano in vivo caratteristiche simili spesso non osservata sotto standard 2-D condizioni di coltura (Figura 1D). Queste caratteristiche includono giunzioni strette, MUCCi produzione, apicale / basale orientamento, nella localizzazione delle proteine vivo, e ulteriori cellule epiteliali di tipo proprietà specifiche.
La progressione da un monostrato di cellule epiteliali completamente differenziate 3-D aggregato varia in base al tipo di cellula 1, 7-13. Campionamento periodico dal bioreattore consente il monitoraggio del epiteliale formazione di aggregati, marcatori di differenziazione cellulare e vitalità (Figura 1D). Una volta che la differenziazione cellulare e formazione di aggregati è stabilito, le cellule sono raccolte dal bioreattore, e simili saggi eseguiti su cellule 2-D possono essere applicati agli aggregati 3-D con alcune considerazioni (Figura 1E-G). In questo lavoro, si descrive la procedura dettagliata di come la cultura in 3-D aggregati di cellule epiteliali del sistema di bioreattore RWV e una varietà di potenziali saggi e analisi che possono essere eseguiti con le 3-D aggregati. Queste analisi includono, ma non sono limitati a, strutturale / mAnalisi orphological (confocale, scansione e microscopia elettronica a trasmissione), di citochine / chemochine e la secrezione di segnalazione cellulare (mediante citometria a matrice tallone e Western blot), le analisi di espressione genica (real-time PCR), tossicologiche / droga analisi e interazioni ospite-patogeno. L'utilizzo di questi test creato le basi per studi più approfonditi ed espansivo come metabolomica, trascrittomica, proteomica e di altre applicazioni basate su array. Il nostro obiettivo è quello di presentare una non convenzionali mezzi di coltura di cellule epiteliali umane per produrre organotipiche modelli 3-D che ricapitolano l'essere umano nel tessuto vivo, in un sistema facile e robusto per essere utilizzato da ricercatori con diversi interessi scientifici.
Protocol
Discussion
L'utilizzo della tecnologia bioreattore RWV qui presentato può fornire ai ricercatori la possibilità di avanzare la loro attuale sistema di coltura cellulare per un modello più fisiologicamente rilevanti organotipica coltura cellulare. Il sistema di bioreattore RWV coltura cellulare fornisce un microambiente shear a bassa che permette alle cellule di formare aggregati cellulari 3-D in vivo, con caratteristiche simili, comprese le giunzioni strette, la produzione di mucina, processi extracellulari (es. mi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare Brooke Hjelm per la sua competenza tecnica e Andrew Larsen per la sua analisi delle proteine. Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Development Alternatives Research Foundation (MMHK) Grant e il NIH NIAID infezioni sessualmente trasmesse e microbicidi topici Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Riconosciamo con gratitudine Biology of Reproduction per il riutilizzo dei dati.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
| PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
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