Kweken en Toepassingen van Rotating muur Schip Bioreactor Afgeleid 3D epitheelcellen modellen
Summary
Een roterende celcultuur die het mogelijk maakt epitheliale cellen om te groeien onder fysiologische omstandigheden resulteert in 3-D cellulaire totale formatie wordt beschreven. De aggregaten gegenereerde weergave<em> In vivo</em>-Achtige eigenschappen niet die in conventionele cultuur modellen en dienen als een meer nauwkeurige organotypische modelsysteem voor een veelheid aan wetenschappelijke onderzoeken.
Abstract
Cellen en weefsels in het lichaam ervaring milieu-omstandigheden die hun architectuur beïnvloeden, intercellulaire communicatie, en de algemene functies. Voor in vitro celcultuur modellen om nauwkeurig na te bootsen het weefsel van belang, de groei omgeving van de cultuur is een cruciaal aspect om te overwegen. Veel gebruikte conventionele celkweek systemen verspreiden epitheliale cellen op een vlakke twee-dimensionale (2-D) ondoordringbare oppervlakken. Hoewel er veel is geleerd van de conventionele celkweek systemen, veel bevindingen zijn niet reproduceerbaar in de menselijke klinische proeven of weefselexplantaten, mogelijk als gevolg van het ontbreken van een fysiologisch relevante micro-omgeving.
Hier wordt beschreven een teeltsysteem dat vele van de cultuur toestand grenzen van 2-D celculturen overwint met de innovatieve roterende wand vat (RWV) bioreactor technologie. Wij en anderen hebben aangetoond dat organotypische RWV-afgeleide modellen kunnen structureel samen te vattene, functie, en authentieke menselijke reacties op externe stimuli op dezelfde wijze als de mens explant weefsels 1-6. De RWV bioreactor is een suspensiekweek systeem dat zorgt voor de groei van epitheelcellen onder lage fysiologische vloeistof schuifkracht. De bioreactoren in twee verschillende formaten, een hoge aspect roterend vat (HARV) of een langzaam draaiende laterale vat (STLV), waarin zij verschillen van de beluchting bron. Epitheelcellen worden toegevoegd aan de bioreactor keuze in combinatie met poreus collageen beklede parels microdrager (figuur 1A). De cellen gebruiken de korrels als groei steiger tijdens de constante vrije val in de bioreactor (figuur 1b). De micro-omgeving die door de bioreactor kan de cellen aan drie-dimensionale (3-D) aggregaten het weergeven van in vivo-achtige kenmerken vormen vaak niet waargenomen onder standaard 2-D kweekomstandigheden (figuur 1D). Deze kenmerken zijn onder andere tight junctions, mucons productie, apicale / basale oriëntatie, in vivo eiwit lokalisatie, en extra epitheliale cel-type specifieke eigenschappen.
De overgang van een monolaag van epitheelcellen een volledig gedifferentieerde 3-D totale varieert afhankelijk celtype 1 7-13. Periodieke bemonstering van de bioreactor zorgt voor monitoring van epitheliale totale formatie, cellulaire differentiatie markers en levensvatbaarheid (figuur 1D). Zodra celdifferentiatie en gaatvorming wordt vastgesteld, worden de cellen geoogst uit de bioreactor en soortgelijke assays uitgevoerd op 2-D cellen kunnen worden op de 3-D aggregaten met een paar overwegingen (figuur 1E-G). In dit werk beschrijven we gedetailleerde stappen van hoe cultuur 3-D-epitheliale cel aggregaten in de RWV bioreactor en een verscheidenheid van potentiële testen en analyses die kunnen worden uitgevoerd met de 3-D aggregaten. Deze analyses omvatten, maar zijn niet beperkt tot, structurele / morphological analyse (confocale, scanning en transmissie elektronenmicroscopie), cytokine / chemokine secretie en cell signaling (cytometrische bead array en Western blot analyse), de analyse van genexpressie (real-time PCR), toxicologische / Analyse van Geneesmiddelen en gastheer-pathogeen interacties. Het gebruik van deze testen het fundament gelegd voor meer diepgaande en uitgebreide studies zoals metabolomics, transcriptomics, proteomics en andere array-gebaseerde applicaties. Ons doel is om een niet-conventionele middelen van het kweken van menselijke epitheelcellen aan organotypische 3-D modellen die de mens in vivo weefsels herhalen, op een gemakkelijke en robuust systeem om te worden gebruikt door onderzoekers met uiteenlopende wetenschappelijke belangen te produceren.
Protocol
Discussion
Gebruik van de RWV bioreactor-technologie hier gepresenteerd kunnen onderzoekers de mogelijkheid om hun huidige celcultuur verder te gaan naar een meer fysiologisch relevante organotypische celkweek model. De RWV bioreactor celkweek systeem zorgt voor een lage shear micro-omgeving die cellen in staat stelt om 3-D cellulaire aggregaten te vormen met in vivo-achtige kenmerken, met inbegrip tight junctions, mucine de productie, de extracellulaire processen (dwz microvilli), en cellulaire polariteit. Het merendeel …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Brooke Hjelm bedanken voor haar technische expertise en Andrew Larsen voor zijn eiwit analyse. Dit werk werd deels gefinancierd door de Alternatives Research Development Foundation (MMHK) Grant en de NIH NIAID seksueel overdraagbare infecties en Topical Microbiciden Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Steeds meer industrieën herkennen Biologie van kopieën voor hergebruik van cijfers.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
| PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O’Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O’Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
