La culture et les applications de rotation bioréacteur de la paroi vasculaire dérivé de modèles 3D de cellules épithéliales
Summary
Système de pile à rotation culture qui permet aux cellules épithéliales de croître dans des conditions physiologiques résultant en 3-D formation d'agrégats cellulaires est décrite. Les agrégats généré affichage<em> In vivo</em>-Comme des caractéristiques non observées dans les modèles classiques de culture et de servir en tant que système modèle organotypique plus précis pour une multitude d'enquêtes scientifiques.
Abstract
Les cellules et les tissus dans les conditions de l'expérience du corps de l'environnement qui influent sur leur architecture, les communications intercellulaires et les fonctions globales. Pour des modèles in vitro de cultures cellulaires avec précision imiter le tissu d'intérêt, le milieu de croissance de la culture est un aspect essentiel à considérer. Couramment utilisés les systèmes classiques de culture cellulaire de propager des cellules épithéliales sur le plat en deux dimensions (2-D) des surfaces imperméables. Bien que beaucoup ait été tirées de systèmes classiques de culture cellulaire, de nombreuses conclusions ne sont pas reproductibles dans des essais cliniques humains ou des explants de tissus, ce qui pourrait à la suite de l'absence d'un micro-physiologiquement pertinent.
Ici, nous décrivons un système de culture qui permet de surmonter bon nombre des limites des conditions de culture de 2-D des cultures de cellules, en utilisant la rotation innovant paroi de la cuve (RWV) la technologie des bioréacteurs. Nous et d'autres ont montré que organotypiques RWV dérivés des modèles peut récapituler structure, la fonction et authentiques réactions humaines à des stimuli externes de même pour les tissus humains explants 1-6. Le bioréacteur RWV est un système de culture en suspension qui permet la croissance des cellules épithéliales dans des conditions de cisaillement faible physiologiques fluide. Les bioréacteurs sont de deux formats différents, un récipient à haute élément rotatif (HARV) ou un navire rotation lente latérale (STLV), dans laquelle ils diffèrent par leur source d'aération. Cellules épithéliales sont ajoutés au bioréacteur de choix en combinaison avec poreux, des billes microsupports revêtus de collagène (figure 1A). Les cellules utilisent les perles comme un échafaudage de croissance au cours de la baisse constante gratuitement dans le bioréacteur (figure 1B). Le microenvironnement fournies par le bioréacteur permet aux cellules de former des agrégats tridimensionnels (3-D) présentant in vivo des caractéristiques similaires souvent pas respectées en vertu de la norme 2-D des conditions de culture (figure 1D). Ces caractéristiques comprennent des jonctions serrées, le MUCnous la production, apicale / basale d'orientation, dans la localisation des protéines in vivo, ainsi que d'autres cellules épithéliales de type des propriétés spécifiques.
La progression d'une monocouche de cellules épithéliales à un totalement différenciées en 3-D agrégat varie en fonction de type 1 de cellules, 7-13. Échantillonnage périodique du bioréacteur permet de surveiller la formation d'agrégats épithéliale, marqueurs de différenciation cellulaire et la viabilité (figure 1D). Une fois la différenciation cellulaire et la formation d'agrégats est établi, les cellules sont récoltées à partir du bioréacteur, et des tests similaires réalisés sur 2 D-cellules peuvent être appliqués aux agrégats 3-D avec quelques considérations (figure 1E-G). Dans ce travail, nous décrivons les étapes détaillées de la façon dont la culture en 3-D des agrégats de cellules épithéliales dans le système de bioréacteur RWV et une variété de dosages potentiels et des analyses qui peuvent être exécutées avec les agrégats 3-D. Ces analyses comprennent, mais ne sont pas limités à, structurel / manalyse orphological (confocale, de numérisation et microscopie électronique à transmission), cytokine / chimiokine sécrétion et la signalisation cellulaire (cytométrie tableau talon et à l'analyse Western blot), l'analyse d'expression génique (PCR en temps réel), toxicologiques / analyse des médicaments et interactions hôte-pathogène. L'utilisation de ces tests a jeté les bases pour des études plus approfondies et expansive comme la métabolomique, la transcriptomique, la protéomique et d'autres applications basées sur réseau. Notre objectif est de présenter des moyens non conventionnels de la culture de cellules épithéliales humaines pour produire organotypiques modèles 3-D qui récapitulent l'humain dans des tissus in vivo, dans un système facile et robuste pour être utilisé par les chercheurs avec les divers intérêts scientifiques.
Protocol
Discussion
L'utilisation de la technologie du bioréacteur RWV présenté ici peut fournir aux chercheurs la capacité de faire progresser leur système actuel de culture cellulaire à un modèle plus physiologiquement pertinente des cellules organotypique culture. Le bioréacteur RWV système de pile à la culture offre un microenvironnement faible cisaillement qui permet aux cellules de former en 3-D agrégats cellulaires in vivo avec des caractéristiques similaires, y compris les jonctions serrées, la production …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Brooke Hjelm pour son expertise technique et Andrew Larsen pour son analyse des protéines. Ce travail a été financé en partie par la Fondation Alternatives recherches pour le développement (MMHK) et le NIH Grant NIAID infections sexuellement transmissibles et les microbicides topiques Cooperative Research Centre IU19 AI062150-01 (MMHK). Nous tenons à remercier Biologie de la Reproduction pour la réutilisation des chiffres.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
| PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
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