Die Züchtung und Anwendungen von Rotating Wand Schiff Bioreaktor Abgeleitet 3D Epithelzellen Models
Summary
Rotierende Zellkultursystem, die Epithelzellen unter physiologischen Bedingungen, die sich in 3-D zellulären Aggregatbildung wachsen kann beschrieben. Die Aggregate erzeugt Display<em> In-vivo-</em>-Ähnlichen Eigenschaften nicht beobachtet bei herkömmlichen Modellen und Kultur dienen als eine genauere organotypischen Modell-System für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Untersuchungen.
Abstract
Zellen und Gewebe im Körper Erfahrung Umweltbedingungen, die ihre Architektur zu beeinflussen, interzelluläre Kommunikation, und die allgemeine Funktionen. Für In-vitro-Zellkultur-Modellen simulieren exakt um das Gewebe von Interesse ist das Wachstum der Kultur-Umgebung ein kritischer Aspekt zu betrachten. Üblicherweise verwendete konventionelle Zellkultursystemen ausbreiten Epithelzellen auf flachen, zweidimensionalen (2D) undurchlässige Oberflächen. Obwohl viel von herkömmlichen Zellkultursystemen erfahren haben, sind viele Ergebnisse nicht reproduzierbar in klinischen Studien am Menschen oder Gewebeexplantate, möglicherweise als Folge des Fehlens eines physiologisch relevanten Mikroumgebung.
Hier beschreiben wir eine Kultur-System, das viele der Kultur Bedingung Grenzen der 2-D-Zellkulturen überwindet, indem Sie die innovative drehbare Wand Gefäß (RWV) Bioreaktor-Technologie. Wir und andere haben gezeigt, dass organotypischen RWV-abgeleiteten Modelle können structur rekapitulierene, Funktion und authentischen menschlichen Reaktionen auf äußere Reize ähnlich wie bei menschlichen Geweben Explantat 1-6. Die RWV Bioreaktor ist eine Suspensionskultur, das für das Wachstum der Epithelzellen unter niedrigen Scherbedingungen physiologischen Flüssigkeit ermöglicht. Die Bioreaktoren in zwei verschiedenen Formaten, eine mit hohem Aspektverhältnis rotierenden Behälter (HARV) oder eine langsam drehende seitlichen Behälter (STLV), in denen sie sich durch ihre Belüftung Quelle stammen. Epithelzellen sind in den Bioreaktor der Wahl in Kombination mit porösen, Kollagen-beschichteten Mikroträgerkügelchen (1A) zugegeben. Die Zellen nutzen die Kügelchen als Wachstumsförderer Gerüst während der konstanten freien Fall in dem Bioreaktor (1B). Die Mikroumgebung des Bioreaktors vorgesehen ermöglicht es den Zellen dreidimensionalen (3-D) Anzeigen Aggregate in vivo-ähnlichen Eigenschaften zu bilden oft nicht unter Standard-2D-Kulturbedingungen (1D) beobachtet. Zu diesen Merkmalen gehören Tight Junctions, mucuns die Produktion, apikale / basale Orientierung, in vivo Protein-Lokalisierung und zusätzliche epithelialen Zelltyp-spezifische Eigenschaften.
Die Progression von einer Monoschicht von Epithelzellen zu einer ausdifferenzierten 3-D-Aggregat hängt vom Zelltyp 1, 7-13 basiert. Regelmäßige Stichproben aus dem Bioreaktor ermöglicht die Überwachung von epithelialen Aggregatbildung, die zelluläre Differenzierung Marker und Lebensfähigkeit (1D). Wenn die zelluläre Differenzierung und Aggregatbildung hergestellt wird, werden die Zellen aus dem Bioreaktor entnommen, und ähnliche Assays 2-D-Zellen durchgeführt werden, um den 3-D-Aggregate mit einigen Überlegungen (1E-G) aufgebracht werden. In dieser Arbeit beschreiben wir eine detaillierte Schritte, wie die Kultur 3-D-Epithelzellen Aggregate in der RWV Bioreaktor und eine Vielzahl von möglichen Tests und Analysen, die mit den 3-D-Aggregate ausgeführt werden kann. Diese Analysen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, strukturelle / morphological Analyse (konfokale, Raster-und Transmissions-Elektronenmikroskopie), Zytokin / Chemokin Sekretion und Zell-Signalisierung (Cytometric Bead Array-und Western-Blot-Analyse), Genexpressionsanalysen (real-time PCR), toxikologischen / Drogen Analyse-und Wirt-Pathogen-Interaktionen. Die Verwendung dieser Assays legte den Grundstein für tiefer gehende Studien und expansiv wie Metabolomik, Transcriptomics, Proteomics und andere Array-basierten Anwendungen. Unser Ziel ist es eine nicht-konventionelle Mittel zur Kultivierung humaner Epithelzellen zu organotypischen 3-D-Modelle, die das menschliche Gewebe in vivo zu rekapitulieren, in einer einfachen und robusten System, um die von Forschern mit vielfältigen wissenschaftlichen Interessen verwendet werden produzieren zu präsentieren.
Protocol
Discussion
Die Verwendung des RWV-Bioreaktor-Technologie kann hier präsentierten Forscher mit der Fähigkeit zu geben, ihre aktuelle Zellkultur-System zu einer physiologisch relevanten organotypischen Zellkultur-Modell voranzutreiben. Die RWV Bioreaktor Zellkultur-System liefert eine niedrige Scherung Mikroumgebung, die Zellen ermöglicht 3-D-zellulären Aggregaten mit in vivo-ähnlichen Eigenschaften, einschließlich Tight Junctions, Muzin-Produktion, extrazellulärer Prozesse (dh Mikrovilli) und zellulären Polarität …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Brooke Hjelm für ihr technisches Know-how und Andrew Larsen danken für seine Protein-Analyse. Diese Arbeit wurde zum Teil durch die Alternativen Research Development Foundation (MMHK) Grant und der NIH NIAID Sexuell übertragbare Infektionen und topischer Mikrobizide Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK) gefördert. Wir danken Biology of Reproduction für die Wiederverwendung von Zahlen.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
| PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
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