回転壁容器バイオリアクター由来3D上皮細胞モデルの培養とその応用
Summary
上皮細胞が3-D細胞凝集体の形成をもたらす生理的条件下で成長することができ、回転細胞培養システムが記載されています。凝集体は、ディスプレイを生成<emin vivoでの></em>のような特性は、従来の培養モデルで観察され、科学的な調査の多数のためのより正確な器官のモデル系としては機能しません。
Abstract
身体の経験、そのアーキテクチャに影響を与える環境条件、細胞間の通信、および全体的な関数の細胞や組織。 in vitroでの細胞培養モデルで正確に目的の組織を模倣するためには、文化の発展環境が考慮すべき重要な側面です。一般的に使用される従来の細胞培養システムのフラット2次元（2-D）不浸透性の表面に上皮細胞を伝播します。多くの従来の細胞培養系から学んだされていますが、多くの知見は、潜在的に生理学的に関連する微小環境の欠如の結果として、人間の臨床試験または組織外植片で再現可能ではありません。
ここでは、革新的な回転壁容器（RWV）バイオリアクター技術を用いて、2次元細胞培養の培養条件の境界の多くを克服する培養系を説明します。我々と他の器官RWVから派生したモデルはstructurを再現することが示されている同様に人間の外植組織1-6外部からの刺激への電子、機能、本物の人間の反応。 RWVバイオリアクターは、低生理流体剪断条件下で上皮細胞の増殖を可能にする懸濁培養システムです。バイオリアクターは、2つの異なる形式で、高アスペクト回転容器（HARV）または彼らは曝気ソースによって異なっている低速回転側容器（STLV）に来る。上皮細胞は、多孔質、コラーゲンコートしたマイクロビーズ（図1A）との組み合わせで、選択したバイオリアクターに追加されます。細胞がバイオリアクターの定数自由落下（図1B）の間に成長の足場としてビーズを利用しています。バイオリアクターによって提供された微小環境は細胞は、しばしば標準的な2-D培養条件（図1D）の下で観察されなかっ生体に似た特性で表示（3-D）は、3次元凝集体を形成することができます。これらの特性は、タイトジャンクション、MUCが含まれていin vivoでのタンパク質の局在化、およびその他の上皮細胞型固有のプロパティで私たちの生産、基底/心尖部の向き、。
完全に分化した3-D集計に上皮細胞の単層からの進行は、細胞の1型、7月13日に基づいて変わります。バイオリアクターからの定期的なサンプリングでは、上皮細胞凝集体形成、細胞分化マーカーと生存率（図1D）のモニタリングが可能になります。一度細胞分化および凝集体形成が確立され、細胞がバイオリアクターから採取され、2-D細胞について行った同様のアッセイは、いくつかの考慮事項（図1E-G）で3-D集約に適用することができます。本研究では、我々はどのようにRWVバイオリアクターシステムと潜在的なアッセイおよび3-D集計を実行することができます分析の様々な文化の3-D上皮細胞凝集体への詳細な手順について説明します。これらの分析は含まれていますが、M /構造が、これらに限定されないorphological分析（共焦点、走査型および透過型電子顕微鏡）、サイトカイン/ケモカインの分泌と細胞内シグナル伝達（サイトメトリービーズアレイおよびウェスタンブロット解析）、遺伝子発現解析（リアルタイムPCR）、薬物/毒物分析と宿主 – 病原体相互作用。これらのアッセイの利用は、メタボロミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、他のアレイ·ベースのアプリケーションなど、より詳細なと広大な研究のための基盤を設定します。私たちの目標は、多様な科学的興味を持つ研究者によって使用されるように容易な、堅牢なシステムでは、 生体組織の人間を再現器官の3次元モデルを生成するために、培養ヒト上皮細胞の非従来型の手段を提示することである。
Protocol
Discussion
ここに提示RWVバイオリアクター技術の活用は、より生理学的に関連する器官の細胞培養モデルに、現在の細胞培養系を前進させる能力を研究者に提供することがあります。 RWVバイオリアクター細胞培養システムは、タイトジャンクション、ムチン産生、細胞外のプロセス（すなわち微）、および細胞の極性を含む生体のような特性にして3-Dの細胞凝集体を形成する細胞を可能に…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、彼のタンパク質分析のための彼女の技術的専門知識とアンドリュー·ラーセンのためにブルックイェルムに感謝します。この作品は、代替の研究開発財団（MMHK）グラントとNIH NIAID性感染症と局所殺ウイルス剤共同研究センターIU19 AI062150-01（MMHK）によって一部で賄われていた。我々は感謝して図の再利用のための生殖の生物学を認める。
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
| PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
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