Dyrking og bruk av roterende Wall Vessel bioreaktor Avledet 3D Epiteliale Cellemodeller
Summary
En roterende cellekultur system som gjør at epitelceller til å vokse under fysiologiske forhold som resulterer i 3-D mobilnettet aggregatdannelse er beskrevet. Aggregatene generert skjerm<em> In vivo</em>-Lignende egenskaper ikke observert i konvensjonelle kultur modeller og tjene som en mer nøyaktig organotypic modell for en rekke vitenskapelige undersøkelser.
Abstract
Celler og vev i kroppen opplevelse miljøforhold som påvirker deres arkitektur, intercellulær kommunikasjon, og overordnede funksjoner. For in vitro cellekultur modeller å nøyaktig etterligne vev av interesse, er veksten miljø av kulturen en kritisk aspekt å vurdere. Vanlig brukte konvensjonelle cellekultur-systemer forplante epitelceller på flate todimensjonale (2D) diffusjonstett overflate. Selv om mye har blitt lært fra konvensjonelle cellekultur-systemer, mange funnene er ikke reproduserbare i kliniske studier eller vev explants, potensielt som et resultat av mangel på en fysiologisk relevant mikromiljøet.
Her beskriver vi en kultur som overvinner mange av kultur tilstand grensene av 2-D cellekulturer, ved hjelp av innovative roterende vegg fartøy (RWV) bioreaktor teknologi. Vi og andre har vist at organotypic RWV-deriverte modeller kan rekapitulere Struktureringe, funksjon, og autentiske menneskelige reaksjoner på eksterne stimuli på samme måte som mennesker eksplantering vev 1-6. Den RWV bioreaktor er en suspensjon kultur system som gjør det mulig for vekst av epitelceller under lave fysiologiske væske skjær forhold. De bioreaktorer kommer i to forskjellige formater, en høy-aspekt roterende fartøy (Harv) eller en langsom-vri lateral fartøy (STLV), der de skiller seg ved sin lufting kilde. Epitelceller legges til bioreaktor av valget i kombinasjon med porøs, kollagen-belagte microcarrier perler (Figur 1a). Cellene utnytte perler som en vekst stillas under konstant fritt fall i bioreaktor (Figur 1B). Mikromiljøet levert av bioreaktor som gjør at cellene danne tredimensjonale (3-D) tilslag viser in vivo-lignende egenskaper ofte ikke observert under standard 2-D kultur forhold (figur 1D). Disse egenskapene inkluderer trange veikryss Münchenoss produksjon, apikal / basal orientering, in vivo protein lokalisering, og ytterligere epiteliale celle-type spesifikke egenskaper.
Progresjonen fra en monolayer av epitelceller til en fullt differensiert 3-D samlet varierer basert på celle type 1, 7-13. Periodisk prøvetaking fra bioreaktor tillater overvåking av epitel aggregatdannelse, cellulær differensiering markører og levedyktighet (figur 1D). Når cellulær differensiering og samlet formasjon er etablert, blir cellene høstet fra bioreaktor, og liknende analyser utført på 2-D cellene kan brukes til 3-D tilslag med noen betraktninger (figur 1E-G). I dette arbeidet, beskriver vi en detaljert fremgangsmåte på hvordan du kultur 3-D epiteliale celler tilslag i RWV bioreaktor systemet og en rekke potensielle analyser og analyser som kan utføres med 3-D aggregater. Disse analysene omfatter, men er ikke begrenset til, strukturelle / morphological analyse (confocal, scanning og transmisjon elektron mikroskopi), cytokin / chemokine sekresjon og cellesignalisering (cytometric perle rekke og Western blot analyse), genekspresjonsanalyse (real-time PCR), toksikologiske / narkotika analyse og host-patogen interaksjoner. Utnyttelsen av disse prøvene dannet grunnlaget for mer grundige og omfattende studier som metabolomics og transcriptomics, proteomikk og andre array-baserte applikasjoner. Vårt mål er å presentere en ikke-konvensjonelle hjelp av dyrking menneskelige epiteliale celler til å produsere organotypic 3-D modeller som rekapitulere den menneskelige in vivo vev, i en lettvinte og robust system som skal brukes av forskere med ulike vitenskapelige interesser.
Protocol
Discussion
Utnyttelse av RWV bioreaktor teknologien som presenteres her kan gi forskere med evne til å fremme sin nåværende cellekultur system til et mer fysiologisk relevant organotypic cellekultur modell. Den RWV bioreaktor cellekultur system gir en lav skjær mikromiljøet som gjør at celler til å danne 3D-mobilnettet tilslag med in vivo-lignende egenskaper, herunder trange veikryss mucin produksjon, ekstracellulære prosesser (dvs. microvilli) og mobilnettet polaritet. Flertallet av data og eksempler som presente…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne ønsker å takke Brooke Hjelm for henne teknisk ekspertise og Andrew Larsen for hans protein analyse. Dette arbeidet ble finansiert delvis av Alternatives Research Development Foundation (MMHK) Grant og NIH NIAID seksuelt overførbare infeksjoner og Aktuelt microbicides Cooperative Research Center IU19 AI062150-01 (MMHK). Vi ønsker å takke for Biology of Reproduction for gjenbruk av tall.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
| PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
References
- Herbst-Kralovetz, M. M., et al. Quantification and comparison of toll-like receptor expression and responsiveness in primary and immortalized human female lower genital tract epithelia. Am. J. Reprod. Immunol. 59 (3), 212-224 (2008).
- Hjelm, B. E., Berta, A. N., Nickerson, C. A., Arntzen, C. J., Herbst-Kralovetz, M. M. Development and characterization of a three-dimensional organotypic human vaginal epithelial cell model. Biol. Reprod. 82, 617-627 (2009).
- Khaoustov, V. I., et al. Induction of three-dimensional assembly of human liver cells by simulated microgravity. In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 35, 501-509 (1999).
- Papadaki, M., et al. Tissue engineering of functional cardiac muscle: molecular, structural, and electrophysiological studies. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 280, 168-178 (2001).
- Ishikawa, M., et al. Reconstitution of hepatic tissue architectures from fetal liver cells obtained from a three-dimensional culture with a rotating wall vessel bioreactor. J. Biosci. Bioeng. 111, 711-718 (2011).
- Carvalho, H. M., Teel, L. D., Goping, G., O’Brien, A. D. A three-dimensional tissue culture model for the study of attach and efface lesion formation by enteropathogenic and enterohaemorrhagic Escherichia coli. Cell Microbiol. 7, 1771-1781 (2005).
- Nickerson, C. A., et al. Three-dimensional tissue assemblies: novel models for the study of Salmonella enterica serovar Typhimurium pathogenesis. Infection and Immunity. 69, 7106-7120 (2001).
- Honer zu Bentrup, K., et al. Three-dimensional organotypic models of human colonic epithelium to study the early stages of enteric salmonellosis. Microbes Infect. 8, 1813-1825 (2006).
- Carterson, A. J., et al. A549 lung epithelial cells grown as three-dimensional aggregates: alternative tissue culture model for Pseudomonas aeruginosa pathogenesis. Infection and Immunity. 73, 1129-1140 (2005).
- Smith, Y. C., Grande, K. K., Rasmussen, S. B., O’Brien, A. D. Novel three-dimensional organoid model for evaluation of the interaction of uropathogenic Escherichia coli with terminally differentiated human urothelial cells. Infection and Immunity. 74, 750-757 (2006).
- Sainz, B., TenCate, V., Uprichard, S. L. Three-dimensional Huh7 cell culture system for the study of Hepatitis C virus infection. Virol J. 6, 103 (2009).
- Duray, P. H., et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J. Infect Dis. 191, 1747-1754 (2005).
- Margolis, L. B., et al. Lymphocyte trafficking and HIV infection of human lymphoid tissue in a rotating wall vessel bioreactor. AIDS Res. Hum. Retroviruses. 13, 1411-1420 (1997).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-497 (1938).
- Beer, B. E., et al. In vitro preclinical testing of nonoxynol-9 as potential anti-human immunodeficiency virus microbicide: a retrospective analysis of results from five laboratories. Antimicrob Agents Chemother. 50, 713-723 (2006).
- Hickey, D. K., Patel, M. V., Fahey, J. V., Wira, C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. J. Reprod. Immunol. 88, 185-194 (2011).
- Andersch-Bjorkman, Y., Thomsson, K. A., Holmen Larsson, J. M., Ekerhovd, E., Hansson, G. C. Large scale identification of proteins, mucins, and their O-glycosylation in the endocervical mucus during the menstrual cycle. Mol. Cell Proteomics. 6, 708-716 (2007).
- Barrila, J., et al. 3D cell culture models: Innovative platforms for studying host-pathogen interactions. Nature Reviews Microbiology. 8, 791-801 (2010).
- Vamvakidou, A. P., et al. Heterogeneous breast tumoroids: An in vitro assay for investigating cellular heterogeneity and drug delivery. J. Biomol Screen. 12, 13-20 (2007).
- Jin, F., et al. Establishment of three-dimensional tissue-engineered bone constructs under microgravity-simulated conditions. Artif Organs. 34, 118-125 (2010).
- Vertrees, R. A., et al. Development of a three-dimensional model of lung cancer using cultured transformed lung cells. Cancer Biol Ther. 8, 356-365 (2009).
- Hwang, Y. S., et al. The use of murine embryonic stem cells, alginate encapsulation, and rotary microgravity bioreactor in bone tissue engineering. Biomaterials. 30, 499-507 (2009).
- Pei, M., He, F., Kish, V. L., Vunjak-Novakovic, G. Engineering of functional cartilage tissue using stem cells from synovial lining: a preliminary study. Clin. Orthop Relat. Res. 466, 1880-1889 (2008).
