Cultura e Aplicações de rotação parede biorreator navio Derivado 3D Modelos de células epiteliais
Summary
Um sistema de cultura rotativa célula que permite que as células epiteliais de crescer sob condições fisiológicas, resultando em 3-D formação de agregados celulares é descrito. Os agregados gerado visor<em> In vivo</em> Características semelhantes não observada em modelos de cultura convencionais e servir como um sistema modelo mais preciso organotípico para uma multiplicidade de investigação científica.
Abstract
Células e tecidos nas condições corporais experiência ambientais que influenciam sua arquitetura, comunicação intercelular e funções gerais. Para nos modelos de cultura in vitro de células com precisão imitar o tecido de interesse, o ambiente de crescimento da cultura é um aspecto crítico a considerar. Comumente utilizados sistemas de cultura de células convencionais propagar células epiteliais em planos bidimensionais (2-D) superfícies impermeáveis. Embora muito tenha sido aprendido a partir de sistemas de cultivo convencional de células, muitos achados não são reprodutíveis em ensaios clínicos humanos ou explantes de tecido, potencialmente como um resultado da falta de um microambiente fisiologicamente relevante.
Aqui, nós descrevemos um sistema de cultura que ultrapassa muitas das fronteiras de cultura de condição de 2-D culturas de células, usando o inovador rotativa parede do vaso (RWV) tecnologia bioreactor. Nós e outros mostraram que organotípicas RWV derivados modelos podem recapitular estruturaçãofunção e, autênticos e respostas humanas a estímulos externos de forma semelhante aos tecidos humanos explante 1-6. O bioreactor RWV é um sistema de cultura em suspensão que permite o crescimento de células epiteliais sob baixas condições de cisalhamento de fluidos fisiológicos. Os biorreactores vêm em dois formatos diferentes, uma alta aspecto recipiente rotativo (HARV) ou de um navio lento-girando lateral (STLV), em que diferem pela sua fonte de arejamento. As células epiteliais são adicionados ao bioreactor de escolha em combinação com colagénio grânulos porosos, revestidos microcarregador (Figura 1A). As células utilizam os talões como um crescimento andaime durante a queda livre constante no bioreactor (Figura 1B). O microambiente fornecido pelo bioreactor permite que as células para formar agregados tridimensionais (3-D) exibem in vivo características semelhantes muitas vezes não observada sob a norma 2-D condições de cultura (Figura 1D). Estas características incluem junções, MUCnos de produção, apical / basal orientação, in vivo de localização de proteínas, e adicionais epiteliais célula do tipo de propriedades específicas.
A progressão de uma monocamada de células epiteliais para um totalmente diferenciados agregado 3-D varia dependendo do tipo de célula 1, 7-13. Amostragem periódica do bioreactor permite a monitorização da formação de agregado epitelial, marcadores de diferenciação celular e viabilidade (Figura 1D). Uma vez que a diferenciação celular e formação de agregados é estabelecida, as células são colhidas a partir do biorreactor, e ensaios semelhantes realizadas em 2-D células pode ser aplicado aos agregados 3-D com algumas considerações (Figura 1E-G). Neste trabalho, nós descrevemos passos detalhados de como a cultura em 3-D agregados de células epiteliais no sistema de bioreactor de RWV e uma variedade de ensaios e análises potenciais que podem ser executados com os agregados 3-D. Estas análises incluem, mas não estão limitados a, estruturais / manálise orphological (confocal, varredura e microscopia eletrônica de transmissão), citocina / quimiocina secreção e sinalização celular por citometria de talão (matriz e análise de Western blot), análise de expressão gênica (PCR em tempo real), toxicológicas / droga análise e agentes patogénicos. A utilização destes ensaios definir as bases para estudos mais aprofundados e expansivo como metabolômica, transcriptômica, proteômica e outras baseadas em arrays aplicações. Nosso objetivo é apresentar meios não-convencionais de cultivo de células epiteliais humanas para produzir organotípicas modelos 3-D que recapitulam o ser humano no tecido vivo, em um sistema fácil e robusto para ser utilizado por pesquisadores com diferentes interesses científicos.
Protocol
Discussion
Utilização da tecnologia de bio-reactor RWV aqui apresentado pode fornecer investigadores com a capacidade para fazer avançar o seu sistema de cultura de células de corrente para um modelo de cultura mais fisiologicamente relevante organotípico célula. O bioreactor RWV sistema de cultura celular fornece um microambiente de baixo cisalhamento que permite que as células para formar 3-D agregados celulares in vivo com características semelhantes, incluindo junções apertadas, a produção de mucina, proce…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Brooke Hjelm por sua perícia técnica e Larsen Andrew para a sua análise de proteínas. Este trabalho foi financiado em parte pela Alternativas de Pesquisa Fundação para o Desenvolvimento (MMHK) Grant eo NIH NIAID Infecções Sexualmente Transmissíveis e microbicidas tópicos Cooperativa Centro de Pesquisa IU19 AI062150-01 (MMHK). Agradecemos Biologia da Reprodução para a reutilização de números.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21131 | Used at 1:500 dilution |
| FACSDiva | BD | Flow cytometer | |
| β-tublin antibody | Calbiochem | 654162 | Used at 1:5000 dilution |
| Bio-Plex 2000 | BioRad | 171-000205 | v5 software |
| Bioreactor and components | Synthecon | RCCS-4 | |
| Cell strainer | BD Falcon | 352340 | 40μm pore size |
| Conical tube (50mL) | Corning | 5-538-60 | |
| Coverslips | VWR | 48366067 | |
| Cytokine bead array kits | BioRad | Custom human kit | |
| Cytodex beads | Sigma | C3275 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| EDTA | Sigma | ED-500G | Ethylenediaminetetraacetic acid |
| Epithelial specific antibody (ESA) | Chemicon | CBL251 | Used at 1:50 dilution |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco | 10438 | Heat inactivated |
| HARV (Disposable) | Synthecon | D-405 | |
| Hydrochloric acid | Sigma | 258148 | 37% |
| Involucrin antibody | Sigma | I 9018 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| MTT reagent | MP Biomedicals, LLC | 194592 | 3-(4,5-Dimethylthiazolyl 1-2)-2,5-Diphenyl Tetrazolium Bromide |
| MUC1 antibody (microscopy) | Santa Cruz | Sc-7313 | Used at 1:50 dilution |
| MUC1 antibody (flow cytometry) | BD Pharmingen | 559774 | Also called CD227, use 20μL per test |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Diluted to 4% in DPBS |
| Petri dish (small) | BD Falcon | 353002 | |
| Polystyrene tube with filter | BD Falcon | 352235 | |
| Polystyrene flow tube | BD Falcon | 352058 | |
| PR antibody | DAKO | M3569 | Used at 1:100 dilution |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36931 | Mounting media with DAPI |
| RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74903 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 71725 | |
| Sterilization pouch | VWR | 11213-035 | |
| Stopcocks (one-way) | Medex | MX5061L | |
| Syringe (10mL) | BD | 309604 | Luer-lock tip |
| Syringe (5mL) | BD | 309603 | Luer-lock tip |
| Trypan Blue | Invitrogen | T10282 | |
| Vp5 antibody | Santa Cruz | sc-13525 | HSV-2 antibody Clone 6F10; used at 1:5000 dilution |
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