MicroRNA Detectie in prostaattumoren op Kwantitatieve Real-time PCR (qPCR)
Summary
Kwantitatieve Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is een snelle en gevoelige methode om de expressie niveaus van verschillende microRNA (miRNA) moleculen te onderzoeken in tumor monsters. Met deze methode uitdrukking van honderden verschillende miRNA-moleculen kunnen worden versterkt, gekwantificeerd en geanalyseerd uit dezelfde cDNA sjabloon.
Abstract
MicroRNA (miRNAs) zijn enkelstrengs 18-24 nucleotide lang niet-coderende RNA-moleculen. Ze zijn betrokken bij vrijwel elke cellulaire proces, inclusief ontwikkeling 1, apoptose 2, en celcyclus 3. MiRNAs worden geschat op de expressie van 30% te regelen tot 90% van de menselijke genen 4 door te binden aan hun doel messenger RNA (mRNA) 5. Wijdverbreide ontregeling van miRNAs is gemeld bij verschillende ziekten en kanker subtypes 6. Als gevolg van de prevalentie ervan en unieke structuur, deze kleine moleculen zijn waarschijnlijk de volgende generatie van biomarkers, therapeutische middelen en / of doelstellingen zijn.
Methoden om aan te miRNA expressie onderzoeken zijn onder andere SYBR groene I dye-basis en Taqman-probe gebaseerde qPCR. Als miRNAs zijn om effectief te worden gebruikt in de klinische setting, is het noodzakelijk dat hun detectie in vers en / of gearchiveerd klinische monsters nauwkeurig, reproduceerbaar, en specific. qPCR is op grote schaal gebruikt voor het valideren van de expressie van miRNAs in hele genoom analyses, zoals microarray studies 7. De monsters in dit protocol van patiënten die waren radicale prostatectomie ondergaan voor klinisch gelokaliseerde prostaatkanker echter andere weefsels en cellijnen kunnen worden vervangen binnen prostaat monsters werden snel bevroren in vloeibare stikstof na verwijdering. Klinische variabelen en follow-up informatie voor elke patiënt werden verzameld voor latere analyse 8.
Kwantificering van miRNA niveaus in de prostaat tumor monsters. De belangrijkste stappen in qPCR analyse van tumoren zijn: Totaal RNA-extractie, cDNA synthese, en detectie van qPCR producten met behulp van miRNA-specifieke primers. Totaal RNA, die mRNA, miRNA, en andere kleine RNA's bevat werden uit monsters met behulp van TRIzol reagens. Qiagen's miScript System werd gebruikt voor het synthetiseren van cDNA en qPCR (figuur 1) uit te voeren. Endogene miRNAs zijn niet polyadenylated, dus tijdens de omgekeerde transcriptie proces, een poly (A) polymerase polyadenylates de miRNA. De miRNA wordt gebruikt als een template voor de synthese van cDNA met oligo-dT en reverse transcriptase. Een universele tag volgorde van het 5'-uiteinde van oligo-dT primers maakt de amplificatie van cDNA in de PCR-stap. PCR amplificatie product wordt waargenomen door de mate van fluorescentie afkomstig van SYBR Green, een kleurstof die intercalates in dubbelstrengs DNA. Specifieke miRNA primers, samen met een universele primer die bindt aan de universele tag volgorde zal versterken specifieke miRNA sequenties.
De miScript Primer Testen zijn beschikbaar voor meer dan duizend mensen specifieke miRNAs, en honderden muizen-specifieke miRNAs. Relatieve kwantificering methode werd hier gebruikt om de expressie van miRNAs te kwantificeren. Om te corrigeren voor variatie tussen de verschillende monsters, is expressie van een doel miRNA genormaliseerd op de expressie van een referentie-gen. De keuze van een gene is om de expressie van doelen normaliseren kritisch relatieve kwantificatie analysemethode. Voorbeelden van genen referentie gewoonlijk in deze hoedanigheid de kleine RNA RNU6B, RNU44 en RNU48 omdat zij als stabiel uit te drukken in de meeste voorbeelden. In dit protocol wordt RNU6B als referentie-gen.
Protocol
Discussion
Afwijkende uitingen van sommige miRNAs zijn consistent gevonden in de prostaat tumoren in vergelijking met normaal weefsel 10, en een aantal van deze miRNAs zijn genoemd als potentiële nieuwe therapeutische middelen tegen prostaatkanker 11. Vandaar de afwijkende expressie van miRNAs kan nuttig diagnostische en / of prognostische biomarkers. De Real-Time qPCR methodiek hier gepresenteerd biedt een test voor een nauwkeurige kwantificering van miRNA niveaus in de prostaat tumor weefsels. De miScript …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Canadese Cancer Society Research Institute, toe te kennen nee. 019038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
