MicroRNA Påvisning i prostata tumorer ved kvantitativ real-time PCR (qPCR)
Summary
Kvantitativ realtids polymerasekædereaktion (qPCR) er en hurtig og følsom metode til at undersøge ekspressionsniveauerne af forskellige microRNA (miRNA) molekyler i tumorprøver. Anvendelse af denne fremgangsmåde ekspression af hundreder af forskellige miRNA molekyler kan forstærkes, kvantificeres, og analyseres fra det samme cDNA-skabelon.
Abstract
MicroRNA (miRNA) er enkeltstrenget, 18-24 nucleotid lange, ikke-kodende RNA-molekyler. De er involveret i stort set alle cellulær proces, herunder udvikling 1, apoptose 2, og cellecyklus regel 3. MiRNA anslås at regulere ekspressionen af 30% til 90% af humane gener 4 ved binding til deres mål-messenger-RNA'er (mRNA'er) 5. Udbredt dysregulering af miRNA er blevet rapporteret i forskellige sygdomme og cancer undertyper 6. På grund af deres forekomst og unik struktur, disse små molekyler er sandsynligvis den næste generation af biomarkører, terapeutiske midler og / eller mål.
Metoder til at undersøge miRNA udtryk omfatter SYBR grønne I farvestof-baserede samt Taqman-sonde baseret qPCR. Hvis miRNA der effektivt kan anvendes i den kliniske omgivelser, er det bydende nødvendigt, at deres opdagelse i friske og / eller arkiverede kliniske prøver være præcise, reproducerbare, og specific. qPCR har været meget anvendt til validering af ekspressionen af miRNA i hele genomet analyser, f.eks microarray studier 7. Prøverne, der anvendes i denne protokol var fra patienter, som gennemgik radikal prostatektomi for klinisk lokaliserede prostatacancer, men andre væv og cellelinier kan være substitueret ind Prostate prøver blev lynfrosset i flydende nitrogen efter resektion. Kliniske variable og opfølgende oplysninger for hver patient blev indsamlet til efterfølgende analyse 8.
Kvantificering af miRNA niveauer i prostata tumorprøver. De vigtigste skridt i qPCR analyse af tumorer er: Total RNA ekstraktion, cDNA syntese, og afsløring af qPCR produkter ved hjælp af miRNA-specifikke primere. Totalt RNA, som omfatter mRNA, miRNA, og andre små RNA'er blev ekstraheret fra prøver med TRIzol reagens. Qiagen s miScript blev anvendt til at syntetisere cDNA og udføre qPCR (figur 1). Endogene miRNA ikke polyadenylated derfor under revers transkription-processen, en poly (A)-polymerase polyadenylates miRNA. MiRNA anvendes som en template til at syntetisere cDNA under anvendelse af oligo-dT og revers transkriptase. En universel tag-sekvens i 5'-enden af oligo-dT-primere letter amplifikation af cDNA ved PCR trin. PCR-produktet amplifikation detekteres ved niveauet af fluorescens udsendt af SYBR Green, et farvestof, som interkalerer i dobbeltstrenget DNA. Specifikke miRNA primere, sammen med en universel primer, som binder til det universelle mærke sekvensen vil amplificere specifikke miRNA sekvenser.
De miScript Primer analyser er tilgængelige for mere end et tusind menneske-specifikke miRNA, og hundredvis af murine-specifikke miRNA. Relativ kvantificering fremgangsmåde blev anvendt her til at kvantificere ekspressionen af miRNA. For at korrigere for forskelle mellem forskellige prøver, er ekspressionsniveauer af et mål miRNA normaliseret til ekspressionsniveauer af en reference-gen. Valget af en GEne, hvorpå der kan normalisere ekspressionen af mål er kritisk i relativ kvantificering analysemetode. Eksempler på referenceniveauer gener der typisk anvendes i denne egenskab er det lille RNA'er RNU6B, RNU44 og RNU48 idet de anses for at være stabilt udtrykt i de fleste prøver. I denne protokol er RNU6B anvendes som reference-genet.
Protocol
Discussion
Afvigende udtryk nogle miRNA har konsekvent fundet i prostatatumorer i forhold til normalt væv 10, og nogle af disse miRNA blevet nævnt som potentielle hidtil ukendte terapeutiske midler mod prostatacancer 11. Derfor de afvigende ekspressionsniveauerne af miRNA kan være nyttige diagnostiske og / eller prognostisk biomarkører. Real-Time qPCR metode præsenteret her giver en analyse for nøjagtig kvantificering af miRNA niveauer i prostata tumorvæv. Den miScript PCR anvendt Systemet kan detekter…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af den canadiske Cancer Society Research Institute, ikke give. 019038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
