MicroRNA-Detektion in Prostatatumoren durch quantitative real-time PCR (qPCR)
Summary
Quantitative Real Time Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) ist eine schnelle und empfindliche Methode, um die Expression verschiedener microRNA (miRNA) Moleküle in Tumorproben zu untersuchen. Unter Verwendung dieses Verfahrens Expression von Hunderten von verschiedenen miRNA-Moleküle können verstärkt, quantifiziert werden, und analysiert die gleiche cDNA-Matrize.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) sind einzelsträngige, 18-24 Nukleotide lange, nicht-kodierende RNA-Moleküle. Sie werden in nahezu allen zellulären Vorgang einschließlich der Entwicklung 1, 2 Apoptose, Zellzyklus-Regulation und 3 beteiligt. MiRNA werden geschätzt, um die Expression von 30% bis 90% der menschlichen Gene 4 zu regulieren durch Bindung an ihre Ziel-Boten-RNA (mRNA) 5. Verbreitet Dysregulation von miRNAs in verschiedenen Erkrankungen und Krebs Subtypen 6 wurde berichtet. Aufgrund ihrer Häufigkeit und einzigartige Struktur sind diese kleinen Moleküle wahrscheinlich die nächste Generation von Biomarkern, therapeutischen Wirkstoffen und / oder Ziele.
Den verwendeten Methoden zur miRNA-Expression zu untersuchen sind SYBR Green I-Farbstoff-Basis sowie TaqMan-Sonde basierte qPCR. Wenn miRNAs, um effektiv im klinischen Umfeld eingesetzt werden sollen, ist es unerlässlich, dass ihr Nachweis im Süß-und / oder archiviert klinischen Proben genaue, reproduzierbare und specific. qPCR wurde in großem Stil für die Validierung Expression von miRNAs in whole genome Analysen wie Microarray-Studien 7 verwendet. Die Beispiele in diesem Protokoll verwendet wurden, waren von Patienten, die radikale Prostatektomie für klinisch lokalisierten Prostatakrebs unterzogen, jedoch in anderen Geweben und Zelllinien können auf Prostata-Präparate ersetzt werden waren-Snap-in flüssigem Stickstoff schockgefroren nach Resektion. Klinische Variablen und Follow-up-Informationen für jeden Patienten wurden für die anschließende Analyse 8 gesammelt.
Die Quantifizierung der miRNA-Ebenen in Prostata-Tumor-Proben. Die wichtigsten Schritte in der qPCR-Analyse von Tumoren sind: Die Gesamt-RNA-Extraktion, cDNA-Synthese und Erkennung von qPCR Produkten mit miRNA-spezifischen Primer. Die Gesamt-RNA, die mRNA, miRNA und andere kleine RNAs enthalten wurden aus Proben mit Trizol Reagenz extrahiert. Qiagen miScript System wurde verwendet, um cDNA zu synthetisieren und führen qPCR (Abbildung 1). Endogene miRNAs sind nicht polyadenylated, also während der reversen Transkription Verfahren polyadenylates ein Poly (A)-Polymerase die miRNA. Die miRNA wird als Matrize zur Synthese von cDNA unter Verwendung von Oligo-dT und Reverse Transkriptase. Eine universelle Tag-Sequenz am 5'-Ende des Oligo-dT-Primer erleichtert die Amplifikation von cDNA in der PCR-Schritt. PCR-Produkt Verstärkung wird durch den Grad der Fluoreszenz von SYBR Green, ein Farbstoff, der in doppelsträngige DNA interkaliert emittiert detektiert. Spezifische Primer miRNA, zusammen mit einem Universal Primer, die zur allgemeinen Tag-Sequenz bindet, zu amplifizieren miRNA Sequenzen.
Die miScript Primer Assays sind für mehr als tausend Menschen-spezifischen miRNAs, und Hunderte von Maus-spezifischen miRNAs zur Verfügung. Die relative Quantifizierung Verfahren wurde hier, um die Expression von miRNAs quantifizieren. Um die Variabilität zwischen den verschiedenen Proben zu korrigieren, wird Expression eines Ziel-miRNA, um die Expression eines Gens Bezug normalisiert. Die Wahl eines gene, auf der die Expression von Zielen zu normalisieren kritisch relative Quantifizierung Analyseverfahren. Beispiele von Referenz-Genen in der Regel in dieser Funktion verwendet werden, sind die kleinen RNAs RNU6B, RNU44 und RNU48 da sie als zu stabil in den meisten Proben ausgedrückt werden. In diesem Protokoll wird RNU6B als Referenz-Gen verwendet.
Protocol
Discussion
Aberrant Ausdrücke einiger miRNAs wurden konsequent in Prostata-Tumoren gefunden werden, wenn zu normalem Gewebe 10, und einige dieser miRNAs wurden als potenzielle neuartige Therapeutika gegen Prostatakrebs 11 benannt verglichen. Daher die aberrante Expression von miRNAs können nützliche diagnostische und / oder prognostischer Biomarker sein. Der Real-Time qPCR hier vorgestellten Methodik stellt einen Assay für eine genaue Quantifizierung von miRNA-Ebenen in Prostata-Tumorgewebe. Die miScript …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der kanadischen Krebsgesellschaft Research Institute finanziert wurde, gewähren keine. 019038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
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