MicroRNA איתור גידולים הערמונית ב כמותי בזמן אמת PCR (QPCR)
Summary
פולימראז כמותי זמן אמת תגובת שרשרת (QPCR) היא שיטה מהירה רגישה כדי לחקור את רמות הביטוי של microRNA שונים (מירנה) מולקולות דגימות הגידול. שימוש בביטוי זה השיטה של מאות מולקולות שונות מירנה יכול להיות מוגבר, לכמת אותה ולנתח אותה מהתבנית cDNA אותו.
Abstract
מיקרו RNA (miRNAs) הם יחיד תקועים, 18-24 נוקלאוטידים ארוכים, ללא קידוד מולקולות RNA. הם מעורבים בכל תהליך כמעט הסלולר כולל 1 פיתוח, אפופטוזיס 2, מחזור התא תקנה 3. MiRNAs מוערך להסדיר את הביטוי של% 30 עד% 90 של הגנים האנושיים 4 באמצעות קשירה שליח היעד שלהם RNAs (mRNAs) 5. Dysregulation נרחב של miRNAs דווחה מחלות סרטן שונות תת 6. בשל השכיחות שלהם מבנה ייחודי, אלו מולקולות קטנות עשויים להיות הדור הבא של סמנים ביולוגיים, סוכני טיפולית ו / או מטרות.
שיטות לחקור ביטוי מירנה כוללים SYBR ירוק אני מבוסס צבען, כמו גם Taqman-בדיקה QPCR מבוסס. אם miRNAs יש להשתמש ביעילות בסביבה קלינית, זוהי חובתו של זיהוי שלהם בדגימות קליניות טריים ו / או בארכיון להיות מדויקת, לשחזור, ו SPecific. QPCR כבר בשימוש נרחב עבור אימות ביטוי miRNAs ב ניתוחים הגנום כולו, כמו מדעי microarray 7. דגימות בשימוש בפרוטוקול זה היו חולים שעברו כריתה רדיקאלית של הערמונית לסרטן ערמונית מקומי קלינית, אולם רקמות אחרות שורות תאים ניתן להחליף בו דגימות הערמונית היו הצמד קפוא בחנקן נוזלי לאחר כריתה. משתנים קליניים מעקב מידע עבור כל מטופל נאספו לצורך ניתוח שלאחר מכן 8.
כימות רמות מירנה בדגימות סרטניים בערמונית. השלבים העיקריים בניתוח QPCR של גידולים הם: סה"כ מיצוי RNA, סינתזה cDNA, זיהוי של מוצרים QPCR באמצעות מירנה פריימרים ספציפיים. RNA כולל, הכולל mRNA, מירנה, ו RNAs קטנים אחרים שהוצאו מן דגימות באמצעות מגיב TRIzol. MiScript של Qiagen מערכת שימש לסנתז cDNA ולבצע QPCR (איור 1). MiRNAs אנדוגניים לא POlyadenylated, ולכן בתהליך שעתוק לאחור, פולימראז פולי (א) polyadenylates מירנה. מירנה משמש כתבנית לסנתז cDNA באמצעות oligo-DT ו – reverse transcriptase. רצף תג אוניברסלית על קצה '5 של oligo-DT primers מאפשר הגברה של cDNA בשלב ה-PCR. הגברה PCR המוצר מזוהה על ידי רמת הקרינה הנפלטת SYBR ירוק, צבע אשר intercalates לתוך ה-DNA גדילי כפול. מירנה פריימרים ספציפיים, יחד עם פריימר יוניברסל הנקשרת רצף תג אוניברסלית יהיה להגביר מירנה רצפים מסוימים.
מבחני פריימר miScript זמינים יותר מאלף בני אדם ספציפיים miRNAs, ומאות Murine ספציפיים miRNAs. שיטת כימות יחסי שימש כאן כדי לכמת את הביטוי של miRNAs. כדי לתקן את השונות בין מדגמים שונים, רמות הביטוי של מירנה היעד מנורמל את רמות הביטוי של הגן התייחסות. הבחירה של GEנה שבו לנרמל את הביטוי של מטרות הוא קריטי שיטת כימות היחסית של הניתוח. דוגמאות של גנים התייחסות המשמשים בדרך כלל במסגרת זו הם RNU6B RNAs קטן, RNU44, ו RNU48 כפי שהם נחשבים לבוא לידי ביטוי ביציבות לאורך רוב דגימות. בפרוטוקול זה, RNU6B משמש הגן התייחסות.
Protocol
Discussion
ביטויים חריגים של miRNAs כמה נמצאו באופן עקבי גידולי הערמונית בהשוואה הרקמות 10, וכמה miRNAs אלה כבר בשם פוטנציאליים סוכני טיפולית חדשנית נגד סרטן הערמונית 11. לפיכך את רמות הביטוי החריג של miRNAs יכול להיות סמנים ביולוגיים אבחון ו / או פרוגנוסטית שימושיים. המתודולו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי האגודה למלחמה בסרטן הקנדית מכון המחקר, לא להעניק. 019038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
