Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)
Summary
Quantitativa reale tempo di reazione a catena della polimerasi (qPCR) è un metodo rapido e sensibile per indagare i livelli di espressione di microRNA (miRNA vari) molecole in campioni tumorali. Usando questo metodo di espressione di centinaia di molecole diverse miRNA possono essere amplificati, quantificati e analizzati utilizzando lo stesso modello cDNA.
Abstract
I microRNA (miRNA) sono a singolo filamento, lunghe 18-24 nucleotidi, non codificanti molecole di RNA. Essi sono coinvolti praticamente in ogni processo cellulare, compreso lo sviluppo 1, apoptosi 2 e regolazione del ciclo cellulare 3. MicroRNA sono stimati per regolare l'espressione del 30% al 90% dei geni umani 4 legandosi al RNA bersaglio loro messaggero (mRNA) 5. La diffusa disregolazione dei miRNA è stata segnalata in varie malattie e sottotipi di cancro 6. Grazie alla loro prevalenza e la struttura unica, queste piccole molecole sono suscettibili di essere la prossima generazione di biomarcatori, agenti terapeutici e / o obiettivi.
I metodi utilizzati per indagare l'espressione miRNA sono SYBR green I dye-based così come Taqman-probe qPCR based. Se miRNA devono essere efficacemente utilizzato in ambito clinico, è indispensabile che la loro rilevazione in campioni clinici freschi e / o archiviati essere precisa, riproducibile e specific. qPCR è stato ampiamente utilizzato per validare l'espressione dei miRNA nelle analisi dell'intero genoma, quali studi di microarray 7. I campioni utilizzati in questo protocollo provenivano da pazienti sottoposti a prostatectomia radicale per tumore della prostata clinicamente localizzato, ma in altri tessuti e linee cellulari possono essere sostituiti dentro i campioni della prostata sono stati snap-congelato in azoto liquido dopo la resezione. Le variabili cliniche e follow-up di informazione per ogni paziente sono stati raccolti per la successiva analisi 8.
Quantificazione dei livelli di miRNA in campioni tumorali della prostata. Le fasi principali nell'analisi qPCR dei tumori sono: estrazione di RNA totale, sintesi di cDNA, e la rilevazione dei prodotti qPCR miRNA utilizzando primer specifici. L'RNA totale, che include mRNA, miRNA, e altri piccoli RNA sono stati estratti da campioni usando il reagente TRIzol. Sistema miScript Qiagen è stato usato per sintetizzare cDNA ed eseguire qPCR (Figura 1). MiRNA endogeni non sono polyadenylated, quindi durante il processo di trascrizione inversa, un poli (A) polimerasi polyadenylates il miRNA. Il miRNA viene utilizzato come modello per sintetizzare cDNA utilizzando oligo-dT e trascrittasi inversa. Una sequenza tag universale della estremità 5 'del primer oligo-dT facilita l'amplificazione del cDNA in fase di PCR. Prodotto di amplificazione PCR viene rilevato dal livello di fluorescenza emessa da SYBR Green, un colorante intercalante che in DNA a doppio filamento. Primer specifici miRNA, insieme con un Primer universale che si lega alla sequenza di tag universale amplificare specifiche sequenze di miRNA.
I saggi Primer miScript sono disponibili per oltre un migliaio di umano-specifici microRNA, e centinaia di murina specifici miRNA. Metodo di quantificazione relativa è qui usato per quantificare l'espressione dei miRNA. Per correggere la variabilità tra campioni differenti, i livelli di espressione di un miRNA bersaglio viene normalizzato i livelli di espressione di un gene di riferimento. La scelta di un gene su cui normalizzare l'espressione di bersagli è critica nel metodo di quantificazione relativa analisi. Esempi di geni di riferimento tipicamente usati in questa capacità sono RNU6B piccolo RNA, RNU44, e RNU48 come sono considerati essere stabilmente espressa nella maggior parte dei campioni. In questo protocollo, RNU6B viene utilizzato come il gene di riferimento.
Protocol
Discussion
Espressioni aberranti di alcune miRNA sono stati costantemente nei tumori della prostata rispetto al tessuto normale 10, e alcuni di questi miRNA sono stati nominati come potenziali agenti terapeutici nuovi contro il cancro della prostata 11. Quindi i livelli di espressione dei miRNA aberranti possono essere utili biomarcatori diagnostici e / o prognostico. The Real-Time qPCR metodologia qui presentata prevede un test per la quantificazione precisa dei livelli di miRNA nei tessuti tumorali della pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato finanziato dalla Canadian Cancer Society Research Institute, concedere no. 019038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
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