MikroRNA Detection i prostatakreft ved Kvantitativ Real-time PCR (qPCR)
Summary
Kvantitativ Real Time polymerase chain reaction (qPCR) er en rask og følsom metode for å undersøke uttrykket nivåer av ulike mikroRNA (miRNA) molekyler i tumorprøver. Ved hjelp av denne metoden uttrykk for hundrevis av forskjellige miRNA molekyler kan forsterkes, kvantifiseres og analyseres fra samme cDNA mal.
Abstract
MicroRNAs (miRNAs) er single-tvinnet, 18-24 nukleotid lange, ikke-kodende RNA-molekyler. De er involvert i praktisk talt alle cellulære prosessen inkludert en utvikling, apoptose 2, og cellesyklus regulering tre. MiRNAs er anslått å regulere uttrykket av 30% til 90% av menneskets gener 4 ved binding til sine mål messenger RNA (mRNA) 5. Utbredt feilregulering av miRNAs har blitt rapportert i ulike sykdommer og kreft subtyper 6. På grunn av sin utbredelse og unike struktur, disse små molekyler er sannsynligvis den neste generasjonen av biomarkører, terapeutiske agenter og / eller mål.
Metoder som brukes til å undersøke miRNA uttrykk inkludere SYBR grønn jeg dye-basert samt Taqman-probe baserte qPCR. Hvis miRNAs er å være effektivt brukes i klinisk setting, er det viktig at deres oppdagelse i ferske og / eller arkiveres kliniske prøver være nøyaktig, reproduserbare, og specific. qPCR har blitt mye brukt for å validere uttrykk av miRNAs i hele genomet analyser som microarray studier 7. Prøvene brukes i denne protokollen var fra pasienter som gjennomgikk radikal prostatektomi for klinisk lokalisert prostatakreft, men andre vev og cellelinjer kan erstattes i. Prostata prøvene ble snap-frosset i flytende nitrogen etter reseksjon. Kliniske variabler og følge opp informasjon for hver pasient ble samlet for senere analyse åtte.
Kvantifisering av miRNA nivåer i prostata tumorprøver. De viktigste trinnene i qPCR analyse av svulster er: Total RNA ekstraksjon, cDNA syntese, og påvisning av qPCR produkter med miRNA-spesifikke primere. Total RNA, som inkluderer mRNA, miRNA, og andre små RNA ble ekstrahert fra prøver med TRIzol reagens. Qiagen har miScript System ble brukt til å syntetisere cDNA og utføre qPCR (figur 1). Endogene miRNAs er ikke polyadenylated derfor under revers transkripsjon prosessen, polyadenylates en poly (A) polymerase den miRNA. Den miRNA brukes som en mal for å syntetisere cDNA ved hjelp av oligo-dT og revers transkriptase. En universell tag sekvens på 5 'enden av oligo-dT primere forenkler forsterkningen av cDNA i PCR trinnet. PCR produkt forsterkning blir oppdaget av nivået av fluorescens slippes ut av SYBR Green, et fargestoff som intercalates inn dobbelt DNA. Spesifikke miRNA primere, sammen med en universal primer som binder seg til den universelle koden sekvensen vil forsterke spesifikke miRNA sekvenser.
De miScript Primer Assays er tilgjengelig i over tusen menneske-spesifikke miRNAs og hundrevis av murine-spesifikke miRNAs. Relativ kvantifisering metoden ble brukt her for å kvantifisere uttrykk for miRNAs. For å korrigere for variasjon blant forskjellige prøver, er uttrykk nivåer av et mål miRNA normalisert til uttrykket nivåer av en referanse gen. Valget av en gene på å normalisere uttrykk for målene er kritisk i forhold kvantifisering metode for analyse. Eksempler på referansenummer gener som vanligvis brukes i denne kapasiteten er den lille RNAS RNU6B, RNU44, og RNU48 som de anses å være stabilt til uttrykk i de fleste prøvene. I denne protokollen, blir RNU6B brukt som referanse genet.
Protocol
Discussion
Avvikende uttrykk for noen miRNAs har vært konsekvent funnet i prostatakreft sammenlignet med normalt vev 10, og noen av disse miRNAs har blitt navngitt som mulige nye terapeutiske midler mot prostatakreft 11. Derav avvikende uttrykk nivåer av miRNAs kan være nyttige diagnostiske og / eller prognostisk biomarkører. The Real-Time qPCR metodikk presentert her gir en analyse for nøyaktig kvantifisering av miRNA nivåer i prostata tumorvev. Det miScript PCR systemet som brukes kan oppdage single n…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av kanadiske Cancer Society Research Institute, gi no. 019038.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596 |
| miScript Reverse Transcription Kit | Qiagen | 218061 |
| miScript Primer Assays | Qiagen | Experiment specific |
| miScript SYBR Green PCR Kit | Qiagen | 218073 |
| LightCycler 3.5 Real-Time PCR System | Roche | |
| Light Cycler Capillaries | Roche | 04929292001 |
| NanoDrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | 2538 |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | G2943CA |
References
- Reinhart, B. J. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16, 1616-1616 (2002).
- Xu, P. The Drosophila microRNA Mir-14 suppresses cell death and is required for normal fat metabolism. Curr. Biol. 13, 790 (2003).
- Bueno, M. J., Perez, d. e. C. a. s. t. r. o., I, ., Malumbres, M. Control of cell proliferation pathways by microRNAs. Cell Cycle. 7, 3143-3143 (2008).
- Friedman, R. C. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92 (2009).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-281 (2004).
- Croce, C. M. Causes and consequences of microRNA dysregulation in cancer. Nat. Rev. Genet. 10, 704 (2009).
- Coppola, V., De, M. R., Bonci, D. MicroRNAs and prostate cancer. Endocr. Relat. Cancer. 17, 1-1 (2010).
- Gordanpour, A. miR-221 Is down-regulated in TMPRSS2:ERG fusion-positive prostate cancer. Anticancer Res. 31, 403-403 (2011).
- Nam, R. K. Expression of the TMPRSS2:ERG fusion gene predicts cancer recurrence after surgery for localised prostate cancer. Br. J. Cancer. 97, 1690 (2007).
- Ambs, S. Genomic profiling of microRNA and messenger RNA reveals deregulated microRNA expression in prostate cancer. Cancer Res. 68, 6162 (2008).
- Liu, C. The microRNA miR-34a inhibits prostate cancer stem cells and metastasis by directly repressing CD44. Nat. Med. 17, 211 (2011).
