Mesoporous सिलिका Biomarker डिस्कवरी के लिए पतली फिल्मों पर कम आण्विक वजन प्रोटीन संवर्धन

Summary

हम एक mesoporous सिलिका मानव सीरम से कम आणविक भार प्रोटीन और पेप्टाइड्स के चयनात्मक वसूली के लिए पतली फिल्म पर आधारित प्रौद्योगिकी विकसित की है. हमारे mesoporous चिप्स की भौतिक रासायनिक गुणों पतले के पेप्टाइड संवर्धन में पर्याप्त नियंत्रण प्रदान करते हैं और फलस्वरूप नैदानिक ​​प्रयोजनों के लिए सीरम proteome प्रोफ़ाइल देखते थे.

Abstract

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.^1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.^4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.⁶ Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.^7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples.

Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.^10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

Protocol

1. चिप निर्माण Hydrolyzed सिलिकेट अग्रदूत समाधान के साथ शुरू से चिप के लिए कोटिंग समाधान बनाएँ. इथेनॉल के 17 एमएल के साथ tetraethylorthosilicate (TEOS) के 14 एमएल मिश्रण, विआयनीकृत और मजबूत सरगर्मी के तहत 6M एचसीएल की 0.5 एमएल पानी की 6.5 एमएल (1200 आरपीएम) का उपयोग कर एक गर्म थाली हलचल. 80 ° C पर 2 घंटे के लिए इस समाधान, गर्मी सरगर्मी लगातार रखने. बहुलक समाधान इथेनॉल के 10 एमएल में मजबूत सरगर्मी के साथ कमरे के तापमान पर वांछित त्रि. ब्लॉक coploymer (F127 pluronic, L121 और P123) जोड़कर तैयार. त्रिकोणीय ब्लॉक copolymer के कमरे के तापमान पर मजबूत सरगर्मी के 2 घंटे के बाद समाधान में सिलिकेट समाधान (1.1 कदम से) के 7.5 मिलीलीटर जोड़कर पूरा मिश्रण. यह अंतिम कोटिंग समाधान का प्रतिनिधित्व करता है. एक 4 इंच स्पिन कोटिंग से 20 सेकंड के लिए 1500 rpm के एक दर पर सिलिकॉन वफ़र कोटिंग समाधान के 1 एमएल लागू करें. 80 पर तो गर्मी ° 12 घंटे के लिए सी. फिल्मों गर्मी जैविक सु हटा425 के तापमान 1 ° प्रति मिनट सी जुटाने rfactant डिग्री सेल्सियस, और फिर 5 घंटे के लिए सेंकना. Mesoporous सिलिका (एमपीएस) ऑक्सीजन प्लाज्मा ashing (मार्च प्लाज्मा प्रणाली प्लाज्मा आशेर) के साथ चिप सतह Pretreat करें. (ओ 2 फ्लो दर: 80 SCCM, बिजली: 300 डब्ल्यू, समय: 10 मिनट). वैकल्पिक सतह रासायनिक संशोधन: मेथनॉल में 3% organosilane में silanate चिप्स: डि (19:01) एक एन 2 दस्ताने बॉक्स में कमरे के तापमान पर 72 घंटे के लिए पानी समाधान. मेथनॉल और डि पानी के साथ क्रमिक रूप से कुल्ला. 110 डिग्री एक प्रशंसक ऑपरेशन ओवन में 15 मिनट के लिए सी चिप्स इलाज. 2. पूर्व उपचार नमूना प्रत्येक सीरम ऐसा है कि अंतिम सांद्रता 0.01% और 5% TFA ACN नमूना TFA और ACN जोड़ें. मिश्रण भंवर. कमरे के तापमान पर एक भंवर प्रकार के बरतन मेज पर 30 मिनट के लिए इन नमूनों को हिला. 3. सीरम Fractionation 160 में पूर्व सेंकना एक ओवन में रात से अधिक चिप्स डिग्री सेल्सियस वैकल्पिक रूप से stor,ई desiccator में चिप्स तक करने के लिए हवा में परिवेश पानी की सतह की जलयोजन को रोकने के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है. संपीड़ित हवा का उपयोग करने से किसी भी कणों धूल है कि चिप की सतह पर हो सकता है. पूर्वनिर्मित कटौती, CultureWell संभाग coverglass खरीदी के लिए कुओं की वांछित संख्या में शामिल हैं. 100% तो और एमपीएस चिप सतह पर जगह इथेनॉल के साथ स्वच्छ coverglass. संदंश साथ coverglass प्रेस नीचे चिप के साथ एक पूरी तरह सील सुनिश्चित करने के लिए. विंदुक प्रत्येक अच्छी तरह से 3 मिमी में 10 सीरम नमूना की μL. कमरे के तापमान पर एक humidified कक्ष में 30 मिनट के लिए सेते हैं. कुओं से सीरम विंदुक और त्यागने. विंदुक 10 विआयनीकृत पानी की एक अच्छी तरह से करने के लिए μL दूर धोने के लिए बड़ा प्रोटीन. 4 बार दोहराएँ. विंदुक 5 μL क्षालन प्रत्येक अच्छी तरह से नमूना बफर (0.1% TFA + 50% ACN). विंदुक ऊपर और नीचे 30 बार जबकि विंदुक टिप के चारों ओर अच्छी तरह से में क्षालन बफर मिश्रण करने के लिए आगे बढ़. (क्षालन बफर को रोकने के लिए एक समय में केवल 1-2 नमूने क्षालन बफर लागूइतनी जल्दी evaporating से). मिश्रण के बाद, एक microcentrifuge ट्यूब में सभी क्षालन बफर और जगह विंदुक MALDI-TOF विश्लेषण करने के लिए तैयार है जब तक. आदेश में एक जैविक नमूने की जटिलता का अनुकरण करने के लिए और हमारे fractionation प्रणाली पर चिप के साथ कम आणविक भार प्रजातियों की कटाई में संवर्धन के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए, हम का चयन किया है और एक व्यापक साथ इकट्ठे प्रोटीन और पेप्टाइड बीस छह अलग प्रजातियों की गिनती के एक मानक मिश्रण आणविक वजन (900-66 500 दा) और PIS (4.0-10.2) और सांद्रता (0.5-8 pmol / μl) की सीमा (तालिका 1 में प्रोटीन सूची देखें). 4. MALDI-TOF पेप्टाइड्स का विश्लेषण स्पॉट MALDI लक्ष्य थाली करने के लिए नमूना 0.5 μL और सूखी अनुमति देते हैं. स्पॉट 0.5 μL मैट्रिक्स (α-cyano-4-hydroxycinnamic एसिड (CHCA), 5 ग्राम / एल) या 50% 0.1% TFA और युक्त acetonitrile में पार 3 ,5 dimethoxy-4 hydroxycinnamic एसिड (SA) की संतृप्त समाधान सह क्रिस्टलीकरण के लिए अनुमति देते हैं. </Li> स्पॉट 0.5 μL और अंशांकन हर अंशांकन स्थान में समाधान के लिए सूखी अनुमति देते हैं. MALDI-TOF मास स्पेक्ट्रोमीटर में लक्ष्य थाली डालें. मशीन नमूना प्रति 4200 और 3000 के शॉट्स के एक लेजर तीव्रता के साथ सकारात्मक प्रतिक्षेपक मोड के लिए सेट किया जाना चाहिए. चयनित जन रेंज 800 से 5000 दा 2000 दा का एक लक्ष्य जन के साथ होना चाहिए. प्रदर्शन रेखीय मोड में एक ही विश्लेषण MALDI-TOF लेकिन 900 से 10,000 या 3000 के लिए 70,000 दा दा और 5000 दा का एक लक्ष्य बड़े पैमाने पर बड़े पैमाने पर सीमा बदलना. 5. डेटा विश्लेषण कच्चे स्पेक्ट्रा ConvertPeakList सॉफ्टवेयर के साथ प्रोसेस किया गया और preprocessing के लिए सॉफ्टवेयर SpecAlign डेटा निर्यात किया गया था. सभी स्पेक्ट्रा PAFFT सहसंबंध विधि और तीव्रता प्रत्येक इसी स्पेक्ट्रम में कुल आयन वर्तमान (घरेलू) के लिए सामान्यीकृत गठबंधन का उपयोग कर रहे थे. सभी स्पेक्ट्रा smoothed और क्रमश: 4 और 0.5 के कारक के साथ डे – noised. चोटियों 0.5, 21 की बड़े पैमाने पर खिड़की और ऊंचाई का एक आधार रेखा के साथ पाया गया1.5 अनुपात, नकारात्मक मूल्यों विश्लेषण से पहले हटा दिया गया. पदानुक्रमित क्लस्टरिंग क्लस्टर 3.0 का उपयोग किया गया था और MapleTree सॉफ्टवेयर के साथ कल्पना. MALDI एमएस डाटा (मी / z शिखर तीव्रता) लॉग इन – बदल, सामान्यीकृत, और मंझला केन्द्रित था. Pearson के सहसंबंध नमूनों के बीच की दूरी की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, और पूरी तरह से उठाना क्लस्टरिंग प्रदर्शन किया था. एक स्वतंत्र छात्र के टी – परीक्षण समूह (n = 2 समूहों) के बीच प्रत्येक का पता चला एमएस शिखर लिए unsupervised पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण करने से पहले की तुलना के लिए इस्तेमाल किया गया था. 0.02 या कम की एक पी मूल्य अलग mesoporous प्रोटिओमिक चिप्स (बड़े pores बनाम छोटे pores के) के बीच विभिन्न काटा पेप्टाइड्स और प्रोटीन का चयन करने के लिए महत्वपूर्ण माना जाता था. 6. प्रतिनिधि परिणाम जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है, इस अध्ययन में हम nanotextures की एक किस्म के साथ mesoporous सिलिका पतली फिल्मों की एक श्रृंखला निर्मित और व्यापक का पता लगायाचयनात्मक पर कब्जा करने और मानव सीरम से LMW पेप्टाइड और प्रोटीन समृद्ध है. चित्रा 2a और ख में ir उपयोग दा 900 से 10,000 की रेंज में पेप्टाइड्स के लिए और 3,000 रेंज में प्रोटीन के लिए unprocessed सीरम नमूना एमएस स्पेक्ट्रा दिखाते ~ क्रमशः 70,000 दा . इन स्पेक्ट्रा अच्छी तरह से ionized है, बहुत ही प्रचुर मात्रा, उच्च आणविक वजन की उपस्थिति के कारण LMW क्षेत्र में संकेत दमन वर्णन Albumin. चित्रा -2 सी और डी के रूप में प्रोटीन (HMW) एमपीएस L121 द्वारा विभाजन के बाद सीरम नमूना एमएस स्पेक्ट्रा को दर्शाती है (ध्यान में लीन होना आकार, 6 एनएम). बड़े अणुओं के बहुमत समाप्त हो गया है, LMW घटकों के एक महत्वपूर्ण संवर्धन में जिसके परिणामस्वरूप. एक नियंत्रण के रूप में, एक ही सीरम नमूना एक nonporous शुद्ध सिलिका सतह पर लागू किया गया था में एमपीएस पतली फिल्मों की विशिष्टता का मूल्यांकन LMWP वसूली के लिए. चित्रा 2e और च के रूप में देखा जा सकता है, वहाँ स्फूर्ति से कोई महत्वपूर्ण कटाईज्वार या प्रोटीन nonporous सिलिका से. इस प्रकार यह निष्कर्ष निकाला जा सकता है कि यह mesoporous वास्तुकला और नहीं सिलिका सतह संबंध कि LMWP के संवर्धन में प्रबल कारक का गठन किया था. ध्यान में लीन होना आकार में ठीक नियंत्रित विविधताओं हाइड्रोफोबिक ब्लॉक लंबाई भिन्न के साथ copolymers के प्रयोग के माध्यम से प्राप्त किया जा सकता है. डिजाइन प्रोटीन और पेप्टाइड मिश्रण का उपयोग करके, LMW पेप्टाइड और प्रोटीन वसूली प्रभावकारिता पर ध्यान में लीन होना आकार के प्रभाव एमपीएस अलग मात्रा के अनुपात के साथ चार Pluronic surfactants (F127, P123, L121, L121 और अधिक सूजन एजेंट) से तैयार की पतली फिल्मों का उपयोग कर जांच की गई हाइड्रोफिलिक और hydrophobic उपकरणों के 3.7 एनएम ध्यान में लीन होना आकार, 5.2 एनएम, 7.4 एनएम, और 9.0 एनएम क्रमशः फार्म. ध्यान में लीन होना आकार की यह रेंज पेप्टाइड्स और आकार और आकार अपवर्जन (चित्रा 3) के माध्यम से एक ही सीरम नमूना से प्रोटीन के विभिन्न प्रदर्शनों की सूची की वसूली के लिए नेतृत्व किया. उच्च आणविक भार पर प्रोटीन स्पेक्ट्राचिप के प्रत्येक प्रकार की कटौती बंद आणविक emonstrate. आकार पर निर्भर HMW प्रोटीन की कमी के अलावा मानकों के समाधान के विभाजन पर चिप एक अंतर है और रोमकूप आकार के साथ जुड़े LMW प्रजातियों की चयनात्मक संवर्धन प्रदर्शित करता है. दो तरह पदानुक्रमित चित्र 3b में प्रस्तुत क्लस्टरिंग LMW मानकों संवर्धन विभिन्न एमएससी के साथ प्राप्त पैटर्न से पता चलता है. यहां तक ​​कि अगर सभी पेप्टाइड चिप्स का कट ऑफ आणविक नीचे हैं, वहाँ ध्यान में लीन होना आकार और फंस प्रजातियों के आणविक वजन के बीच एक सकारात्मक संबंध है. बड़े pores, 9 एनएम, के साथ एमएससी preferentially बड़ा पेप्टाइड्स फसल, जबकि छोटे पेप्टाइड्स छोटे pores के साथ चिप्स द्वारा और अधिक कुशलता से बरामद कर रहे हैं. mesoporous व्यवस्था की संरचनात्मक परिवर्तन टेम्पलेट बहुलक की एकाग्रता ट्यूनिंग द्वारा किया गया. टेम्पलेट बहुलक की एकाग्रता बढ़ाने के चरणों के बीच एक कम interfacial वक्रता के परिणामस्वरूपपानी, copolymer, और सिलिकेट, फलस्वरूप एक गोलाकार से एक बेलनाकार संरचना करने के लिए interrelated प्रगति की शुरुआत. F127 pluronic, इसकी उच्च आण्विक भार के साथ, संरचनात्मक आवधिकता के इस उच्च स्तर के पास. समाधान शुरू में F127 की एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा, विभिन्न एमपीएस पतली फिल्म आवधिक nanostructures के nanostructure से 3 डी 2 डी nanostructure प्राप्त किया जा सकता है. 3 डी घन और मधुकोश हेक्सागोनल nanostructures, अधिक वांछनीय nanopore interconnectivity और अधिक सुलभ nanopore morphology रखने, चुनिंदा 2D हेक्सागोनल संरचना से LMW पेप्टाइड्स समृद्ध में बेहतर प्रदर्शन दिखा रहे हैं, भले ही वे इसी तरह के ध्यान में लीन होना आकार वितरण और सीरम के लिए एक ही कटौती बंद आणविक का हिस्सा fractionation (चित्रा 4). हम भी सुव्यवस्थित एमपीएस चिप्स पर organo-silane ऑक्सीजन प्लाज्मा शुरू करने के लिए चिप सतह pretreat ashing विकार. आदेश में गुणात्मक चुनें पर electrostatic प्रभाव का अध्ययन करने के लिएive के संवर्धन पर चिप, हम प्रोटीन और पेप्टाइड मिश्रण का उपयोग करें. एमएस प्रोटिओमिक मानकों एमपीएस L121 साथ तैयार चिप्स पर fractionated और रासायनिक कार्य समूहों के साथ संयुग्मित समाधान के विश्लेषण चित्रा 5 में प्रस्तुत किया है. का आरोप लगाया सकारात्मक और नकारात्मक आरोप लगाया पेप्टाइड्स और LMW प्रोटीन ऋणयानी और cationic चिप्स पर कब्जा कर रहे हैं क्रमशः. सकारात्मक निवल प्रभारी के साथ पेप्टाइड्स उबरने में कई एमपीएस चिप्स के मात्रात्मक तुलना चित्रा 5a में प्रदर्शित किया जाता है. नकारात्मक प्रभारी और चिप्स के साथ किसी भी संशोधन (एक छोटी सी नकारात्मक चार्ज मूल के साथ) के बिना चिप्स APTES (राष्ट्रीय राजमार्ग 2) के साथ संशोधित चिप्स की तुलना में उन पेप्टाइड्स के लिए काफी अधिक संवर्धन दिखा रहे हैं. इसके विपरीत, सकारात्मक आरोप लगाया एमपीएस चिप्स असाधारण क्षमता के अधिकारी करने के लिए नकारात्मक शुद्ध प्रभारी के साथ उन पेप्टाइड्स ठीक है, के रूप में चित्रा 5 ब में प्रदर्शन. जबकि α endorphin एक महत्वपूर्ण परिवर्तन घ नहीं दिखा हैलगभग 6 इसके पीआई के लिए ue. चित्रा 1 एमपीएस चिप्स और fractionation LMW संवर्धन के सिद्धांत. नमूना की सतह पर खोलना करने के बाद, LMW प्रोटीन और पेप्टाइड pores में फंस रहे हैं, जबकि बड़ी प्रजाति pores के बाहर रह रहे हैं और वाशिंग चरणों के दौरान हटा दिया. समृद्ध भिन्न और फिर eluted और MALDI से विश्लेषण कर रहे हैं. चित्रा 2 पेप्टाइड mesoporous सिलिका पतली फिल्म चिप्स का उपयोग कर संवर्धन. दोनों कम द्रव्यमान (900 10 000 दा) रेंज और उच्च द्रव्यमान (3000 70 दा 000) से पहले रेंज (ए, बी) और (ग, घ) mesoporous सिलिका पतली फिल्मों पर सीरम प्रसंस्करण (के बाद MALDI एमएस प्रोफाइल L121, 6 एनएम). आणविक वसूली काफी कम हो जाता है जब रिक्त nonporous सिलिका सतहों (ई, च) का उपयोग कर. <img alt="चित्रा 3" src="Files/ftp_upload/3876/3876fig3.jpg /" /> चित्रा 3 एमपीएस चिप्स के आण्विक कट ऑफ और आकार पर निर्भर संवर्धन. (क) MALDI स्पेक्ट्रा के प्रत्येक एमपीएस चिप्स ध्यान में लीन होना आकार को correlating की विशेषता कटौती बंद आणविक प्रदर्शन बढ़ाया दृश्य. (ख) विभिन्न चिप्स के बीच पेप्टाइड मिश्रण सुविधाओं के दो तरह पदानुक्रमित क्लस्टरिंग. लाल या पीले रंग की तीव्रता रिश्तेदार पेप्टाइड एकाग्रता इंगित करता है. बड़े pores बड़ा पेप्टाइड्स (3600 से 8500 दा के लिए) की कटाई बढ़ाया है, जबकि छोटे पेप्टाइड (900 3500 दा से) preferentially छोटे pores के साथ चिप्स से बरामद किए गए. चित्रा 4 एमपीएस पतली फिल्मों और अलग nanostructures साथ चयनात्मक वसूली की शारीरिक अभिलक्षण. XRD पैटर्न (क, ख, ग), (इनसेट एक, ख, ग) मंदिर, अग्रदूत समाधान में अलग सांद्रता में F127 Pluronic: 4.0 ×10 -3 (क) एम, 6.0 × 10 एम -3 (ख), और 8.0 × 10 एम -2 (ग). (घ) 3 डी घन और 3 डी हेक्सागोनल F127 प्रोटिओमिक चिप्स (पशुशावक और हेक्स, क्रमशः) पर चयनात्मक वसूली illustrating के पेप्टाइड्स का पता लगाने की तीव्रता के बार ग्राफ. विभिन्न संरचनात्मक संशोधनों के एक चयनात्मक संवर्धन के वर्तमान. चित्रा 5 प्रभार अलग सतह के कार्यों के साथ चिप्स के लिए विशेष वसूली. चुनिंदा functionalized चिप्स पर कब्जा कर लिया पेप्टाइड्स का पता लगाने के एमएस तीव्रता के बार ग्राफ. उनके आईएसओ बिजली बिंदु के अनुसार, पेप्टाइड्स सकारात्मक या नकारात्मक पीएच 7.0 पर आरोप लगाया है. (क) सकारात्मक (पेप्टाइड (1) des-Arg1 Bradykinin, (2) Bradykinin, (3) पी एमाइड पदार्थ, (4), Neurotensin, (5) (1-17) ACTH, (6) (ACTH के 7 38)) विशेष रूप से नकारात्मक आरोप लगाया सुर को समृद्ध कर रहे हैंचेहरे. (ख) नकारात्मक पेप्टाइड्स (7 () Glu1 थॉम्बिन की क्रिया द्वारा रक्त के जमने के दौरान कोई ब्रिनोजेन के द्वारा हटाया गया पदार्थ बी (8) α endorphin, (9) (18-39), ACTH है, (10) इंसुलिन, (11) EGF, (12) GFII इंसुलिन की तरह) हैं सकारात्मक आरोप लगाया सतहों पर विशेष रूप से समृद्ध है. चित्रा 6 fractionated सीरम पर चिप स्थिरीकरण. (क) प्रतिनिधि LMW पेप्टाइड और प्रोटीन की MALDI प्रोफाइल सीरम fractionation (ऊपर) के तुरंत बाद या कमरे के तापमान (नीचे) पर 3 पर चिप भंडारण के विकेटकीपर के बाद eluted. (ख) ऊपर से नीचे तक: प्रत्येक को दोहराने में पता चला एमएस चोटियों की औसत तीव्रता के रेखीय प्रतिगमन विश्लेषण के हौसले fractionated सीरम और सीरम fractionated के बाद कमरे के तापमान पर 3wk एमपीएस चिप्स भंडारण के लिए 1 को दोहराने के तुलना में. समीकरण, CV, और दृढ़ संकल्प के गुणांक (2 आर) का संकेत कर रहे हैं.

Discussion

सबूत बढ़ते है कि संचार proteome के कम आणविक वजन क्षेत्र रोग का जल्दी पता लगाने के लिए एक नैदानिक ​​biomarkers के एक अमीर स्रोत है. इस प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में, हम अलग ध्यान में लीन होना आकार, ताकना संरचनाओं और संशोधन करने के लिए चुनिंदा पेप्टाइड्स और कम आणविक भार प्रोटीन समृद्ध के साथ mesoporous सिलिका चिप्स की एक श्रृंखला प्रस्तुत की. प्रोटीन स्थिरता का मूल्यांकन करने के लिए, एमपीएस चिप्स मानव सीरम, धोने के बाद सूखे के साथ incubated रहे थे, और कमरे के तापमान पर 3wk के लिए संग्रहीत. पैटर्न प्राप्त प्रोटीन पेप्टाइड / हौसले fractionated सीरम की उन (6a चित्रा), के रूप में सांख्यिकीय चित्र 6b में पता चला विश्लेषण के परिणामों से पुष्टि के साथ तुलनीय थे. पीक औसत CV के द्वारा मापा संकेतों की परिवर्तनशीलता कच्चे सीरम के लिए 12.7% और fractionated नमूने के लिए 14.2% पर अनुमान लगाया गया था. सीमांत विविधताओं के MALDI साधन की आंतरिक परिवर्तनशीलता के कारण हो और सुझाव हो सकता है कि ओn चिप pretreatment और भंडारण एमएस प्रोटीन प्रोफाइल के किसी भी महत्वपूर्ण परिवर्तन के लिए प्रेरित नहीं किया. गैर झरझरा सिलिकॉन पर ही प्रयोग किया गया है. सूखे सिलिकॉन की सतह पर भंडारण के बाद बरामद सीरम MALDI विश्लेषण से पहले एमपीएस चिप्स पर fractionated था. गरीब एमएस प्रोफ़ाइल mesoporous सतह की स्थिरीकरण लाभ प्रदर्शन प्राप्त की. पहले माने तंत्र के साथ तुलना में, हम परिकल्पना है कि LMW nanopores के अंदर फंस प्रजातियों गिरावट से proteases के आकार अपवर्जन के माध्यम से संरक्षित किया गया, या में nanopores की सीमित स्थान में उनके proteolytic गतिविधि की steric निषेध द्वारा. एमपीएस चिप आधारित पद्धति और जटिल जैविक तरल पदार्थ के अध्ययन के LMW प्रोटीन रूपरेखा पेप्टाइड में एक शक्तिशाली उपकरण किया जा सकता है. एमपीएस चिप्स के निर्माण और उत्पादन के लिए ऊपर पहुंचा नमूनों की एक बड़ी संख्या के साथ – साथ प्रसंस्करण प्राप्त करने की अनुमति के लिए सस्ती कर रहे हैं, खोजपूर्ण स्क्रीनिंग और जैव के लिए लाभप्रद सुविधाएँ प्रदानमार्कर खोज.

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Tetraethoxysilane	Sigma-Aldrich	131903	98%
Spin coater	Brewer Science	Cee 200X
Plasma Asher	Nordson March	AP-600
Spectroscopic Ellipsometer	J. A. Woollam Co.	M-2000DI
MALDI-TOF	Applied Biosystems	Voyager-DE-STR
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich Co.	C8982	Matrix for MALDI-TOF
trans-3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acid	Sigma-Aldrich Co.	85429	Matrix for MALDI-TOF
Stir hot plate	Thermo Scientific	11-475-30Q
CultureWell chambered coverglass	Sigma-Aldrich	GBL103350	3 mm diam. ×1 mm depth, 3-10 μL, sterile
Pluronic F 127	BASF		PEO106-PPO70-PEO106
Pluronic L121	BASF		PEO5-PPO70-PEO5
Pluronic P123	BASF		PEO20-PPO70-PEO20

Table 1. Physico-chemical properties and designed concentrations (Molecular weight and Iso-electric point) of the selected peptide and protein standards.