Caryotype spectral pour l'étude d'anomalies chromosomiques dans les humains et les souris de la maladie polykystique des reins
Summary
Caryotype spectral (SKY) est une technique avancée cytogénétique à identifier aberrations génomiques et chromosomiques. Cette technique tire avantage des sondes de peinture chromosomique, ce qui permet la classification de tous les chromosomes. SKY peut également identifier des aberrations chromosomiques complexes et les défauts d'isolement chez les souris et les humains atteints de diverses maladies, y compris la maladie polykystique des reins.
Abstract
Méthode conventionnelle pour identifier et classer des chromosomes individuels dépend de la configuration unique des bandes de chaque chromosome dans une espèce spécifique en cours d'analyse 1, 2. Cette technique classique de baguage, cependant, n'est pas fiable dans l'identification des aberrations chromosomiques complexes tels que ceux associés au cancer. Pour surmonter les limites de la technique de baguage, caryotype spectral (SKY) est introduite pour fournir beaucoup d'informations fiables sur les anomalies chromosomiques.
SKY est une fluorescence multicolore hybridation in situ (FISH) technique pour détecter les chromosomes en métaphase avec un microscope spectrale 3, 4. SKY a été prouvé être un outil précieux pour l'analyse cytogénétique d'un large éventail d'anomalies chromosomiques associées à un grand nombre de maladies génétiques et les tumeurs malignes 5, 6. SKY implique l'utilisation de sondes multicolores d'ADN par fluorescence-labellisés préparés à partir de l'oligonucle dégénéréeamorces otide par PCR. Ainsi, chaque chromosome a une couleur spectrale unique après dans-in situ hybridation avec des sondes, qui sont marquées de façon différentielle avec un mélange de colorants fluorescents (rhodamine, Texas Red, Cy5, FITC et Cy5.5). Les sondes utilisées pour SKY comporter jusqu'à 55 sondes chromosomiques spécifiques 7-10.
La procédure pour SKY comporte plusieurs étapes (Figure 1). SKY nécessite la disponibilité de cellules avec index mitotique élevé à partir de tissu normal ou malade ou de sang. Les chromosomes d'une cellule unique à partir d'une cellule fraîchement isolés primaire ou une lignée cellulaire sont étalées sur une lame de verre. Cette propagation chromosome est marqué avec une combinaison différente de colorants fluorescents spécifiques pour chaque chromosome. Pour sonde de détection et d'acquisition d'image, le système d'imagerie spectrale se compose de l'interféromètre de Sagnac et une caméra CCD. Ceci permet de mesurer le spectre de la lumière visible émise par l'échantillon et d'acquérir une image spectrale vientchromosomes m individuels. HiSKY, le logiciel utilisé pour analyser les résultats des images capturées, fournit une identification facile des anomalies chromosomiques. Le résultat final est une métaphase et une image de classification caryotype, dans lequel chaque paire de chromosomes a une couleur distincte (figure 2). Cela permet une identification facile des identités et des translocations chromosomiques. Pour plus de détails, s'il vous plaît visitez le site Web Applied Spectral Imaging ( http://www.spectral-imaging.com/ ).
SKY a été récemment utilisé pour l'identification des défauts de ségrégation des chromosomes et des anomalies chromosomiques chez l'homme et la souris avec rénale autosomique dominante polykystique (PKRAD), une maladie génétique caractérisée par un dysfonctionnement dans les cils primaires 11-13. En utilisant cette technique, nous avons démontré la présence de la ségrégation des chromosomes anormaux et anomalies chromosomiques chez les patients PKRAD et des modèles de souris 14. Des analyses plus poussées en utilisant SKY non seulement nous a permis d'identifier nombre chromosomique et de l'identité, mais aussi de détecter avec précision très complexes aberrations chromosomiques telles que des délétions chromosomiques et des translocations (figure 2).
Protocol
Discussion
Caryotype spectral (SKY) est une technique utilisée dans l'étude cytogénétique des compositions génomiques et chromosomiques. Cette technique tire avantage des sondes de peinture chromosomique, et la détection de ces sondes sont acquis par un interféromètre de Sagnac. Le processus complet SKY prend habituellement environ une semaine, et il comporte plusieurs étapes clés (figure 1). Le SKY utilise un protocole standard, qui a d'abord été décrit par Padilla Nash et al 3….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs tiens à remercier Brian Muntean, Shao Lo, Maki Takahashi et Blair Mell pour leur assistance technique. Ce travail a été soutenu par des prix du NIH (DK080640) et l'Université de Toledo & ProMedica de bourses de recherche translationnelle de stimulation à M. Surya Nauli.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalog number | Comments |
| DMEM | Cellgro Mediatech Inc. | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30088-03 | |
| Penecillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Colcemid | Roche Diagnostics | 10 295 892 001 | 10 μg/ml |
| HCl | Fisher Scientific | A144-500 | |
| KCl | Fisher Scientific | S77375-1 | |
| Phosphate buffered saline | Thermo Scientific | SH30256-01 | |
| SKY paint probe kit (Human) | Applied Spectral Imaging | SKY000028 | |
| SKY paint probe kit (Mouse) | Applied Spectral Imaging | SKY000030 | |
| Concentrated antibody detection kit | Applied Spectral Imaging | SKY000033 | |
| Trypsin | Thermo Scientific | SH30236.01 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A433P-4 | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A38-212 | |
| RNase A | Roche Diagnostics | 10 109 169 001 | |
| Pepsin | Sigma-Aldrich | P6887-5G | |
| MgCl2 | Fluka | 63069-500ML | |
| 37% Formaldehyde | Mallinckrodt Baker | 2106-02 | |
| 20X SSC | Promega | V4261 | |
| Formamide | Fluka | 47671 | prepare just before use |
| Tween-20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Microscope glass slides | Fisher Scientific | 12-549 | |
| Microscope cover glass 24x60mm | VWR Vista Vision | 16004-312 | |
| Rubber cement | Elmer’s (local retail store) | ||
| Hybridization/ humidifiedchamber/Tray | Simport | M920-2 | put wet paper towels at the bottom |
| Thermocycler | Eppendorf | Epgradient S | |
| Shaking platform/Orbital shaker | Bellco Biotechnology | ||
| Shaking/water bath | Precision Scientific | ||
| DAPI filter cube | Chroma Technology | ||
| SKY filter cube | Chroma Technology | ||
| SpectraCube | Applied Spectral Imaging | ||
| Inverted cell culture microscope | Nikon | Nikon Eclipse TS100 | |
| Fluorescence microscope | Olympus | IX70 | 60X oil |
References
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