In-vitro-Assay Mesothelzellen Ausverkauf, dass die Modelle der frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs
Summary
Die Mesothelzellen-Clearance-Test hier beschriebenen nutzt die Vorteile der fluoreszenzmarkierten Zellen und Zeitraffer-Video-Mikroskopie zu visualisieren und quantitativ zu messen die Wechselwirkungen von Eierstockkrebs mehrzelligen Sphäroiden und Mesothelzelle Monoschichten. Dieser Test modelliert die frühen Schritte der Metastasierung Eierstockkrebs.
Abstract
Eierstockkrebs ist die fünfte führende Ursache von Krebs verursachten Todesfälle in den Vereinigten Staaten ein. Trotz eines positiven ersten Reaktion auf Therapien, entwickeln 70 bis 90 Prozent der Frauen mit Eierstockkrebs neue Metastasen, und die Rezidivrate ist oft tödlich 2. Es ist daher notwendig, zu verstehen, wie sekundäre Metastasen entstehen, um bessere Behandlungen für Zwischen-und Spätstadium Eierstockkrebs entwickeln. Ovarialkarzinom Metastasen tritt auf, wenn bösartige Zellen aus dem Primärtumor Ort lösen und zu verbreiten, in der gesamten Bauchhöhle. Die disseminierten Zellen können vielzelligen Cluster oder Sphäroide, die entweder ungebunden bleiben wird, oder das Implantat auf Organe in der Bauchhöhle 3 (Abbildung 1, Movie 1) zu bilden.
Alle Organe in der Bauchhöhle mit einem einzigen, kontinuierlichen, Schicht von Mesothelzellen 4-6 (2) ausgekleidet ist. Allerdings sind Mesothelzellen abwesend von untenPeritoneal Tumormassen, wie durch eine elektronenmikroskopische Aufnahme von Studien ausgeschnitten humanem Tumorgewebe Abschnitten 3,5-7 (2) offenbart. Dies deutet darauf hin, dass Mesothelzellen von der Unterseite der Tumormasse sind von einem unbekannten Prozess ausgeschlossen.
Zurück in vitro Experimente zeigten, dass primäre Ovarialkarzinom Zellen effizienter zu befestigen extrazellulären Matrix, als Mesothelzellen 8, und neuere Studien zeigten, dass die primäre peritoneale Mesothelzellen tatsächlich eine Barriere für Eierstockkrebs Zelladhäsion und Invasion (im Gegensatz zu Adhäsion und Invasion im Vergleich auf Substraten, die nicht mit Mesothelzellen bedeckt waren) 9,10. Dies würde darauf hindeuten, dass Mesothelzellen als Barriere gegen Eierstock-Krebs Metastasen handeln. Die zellulären und molekularen Mechanismen, durch die Eierstockkrebszellen diese Barriere zu durchbrechen, und schließt die Mesothel haben bis vor kurzem unbekannt geblieben.
Hier beschreiben wir the-Methodik für ein in-vitro-Test, dass die Modelle der Wechselwirkung zwischen Eierstockkrebszelllinien Sphäroide und Mesothelzellen in vivo (Abbildung 3, Movie 2). Unser Protokoll wurde von bisher beschriebenen Methoden zur Analyse Eierstocktumorzelllinien Interaktionen mit Mesothelzellen Monoschichten 16.8 angepasst, und wurde zum ersten Mal in einem Bericht zeigt, dass Eierstocktumorzellen verwenden einen Integrin-abhängige Aktivierung von Myosin und Zugkraft auf den Ausschluss von der Förderung beschrieben Mesothelzellen von unter einem Tumor Sphäroid 17. Dieses Modell nutzt die Vorteile der Zeitraffer-Fluoreszenz-Mikroskopie, die beiden Zellpopulationen in Echtzeit zu überwachen und bietet räumliche und zeitliche Informationen über die Wechselwirkung. Die Eierstockkrebs exprimieren rot fluoreszierendes Protein (RFP), während die Mesothelzellen grün fluoreszierendes Protein (GFP). RFP-exprimierenden Eierstockkrebszelllinien Sphäroiden auf die GFP-exprimierenden Mesothelzellen Monoschicht zu befestigen. Die Sphäroide Verbreitung, einzudringen, undzwingen die Mesothelzellen beiseite schaffen ein Loch in der Monoschicht. Dieses Loch wird visualisiert als der negative Raum (schwarz) in der GFP-Bild. Die Fläche des Loches kann dann gemessen werden, um quantitativ die Unterschiede hinsichtlich des Clearance-Aktivität zwischen der Kontrolle und Populationen von Eierstockkrebs und / oder Mesothelzellen werden. Dieser Assay erfordert nur eine kleine Anzahl von Eierstockkrebszellen (100 Zellen pro Sphäroid x 20-30 Sphäroide pro Bedingung), so ist es möglich, diesen Assay unter Verwendung von wertvollen primären Tumorzelle Proben. Ferner kann dieser Assay einfach für Hochdurchsatz-Screening angepasst werden.
Protocol
Discussion
Der "Ausverkauf Mesothelzellen Assay" präsentiert hier verwendet Zeitraffer-Mikroskopie, um die Wechselwirkungen von Eierstockkrebs mehrzelligen Sphäroiden und Mesothelzellen Zellmonolayern überwachen, in der großen räumlichen und zeitlichen Detail. Zuvor hatten mehrere Gruppen 8-14 Endpunkt-Assays verwendet werden, um zu zeigen, dass Eierstock-Krebszellen zu befestigen und dringen in Mesothelzelle Monoschichten. Dieser Assay ist einzigartig, da sie verwendet fluoreszenzmarkierten Zellen Tumorz…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten das Nikon Imaging Center an der Harvard Medical School, speziell Jennifer Waters, Lara und Wendy Petrak Lachs, für die Ausbildung und den Einsatz ihrer Zeitraffer Mikroskope danken. Wir möchten auch an Rosa Ng und Achim Besser für wertvolle Diskussionen danken. Diese Arbeit wurde vom NIH Grant 5695837 (an M. Iwanicki) und GM064346 zu GKI unterstützt; durch einen Zuschuss von Dr. Miriam und Sheldon G. Adelson Medical Research Foundation (bis GKI).
Materials
| Reagent | Company | Catalog Number | Comments |
| OVCA433 Ovarian Cancer Cells | Gift from Dr. Dennis Slamon | ||
| ZT Mesothelial Cells | Gift from Dr. Tan Ince | ||
| Medium 199 | Gibco | 19950 | |
| MCDB105 | Cell Applications Inc. | 117-500 | |
| FBS-heat inactivated | Gibco | 10082 | |
| Pen-Strep | Gibco | 15070 | |
| 96 well plates | Corning Costar | 3799 | |
| Polyhydroxyethylmethacrylate (poly-HEMA) | Sigma Aldrich | 192066-25G | For poly-HEMA solution dissolve 6mg poly-HEMA powder in 1ml of 95% EtOH |
| EtOH | Pharmco-aaper | 111ACS200 | Dilute to 95% in dH20 |
| Cell culture hood | Nuaire | NU-425-300 | |
| Tissue culture incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| incubator for poly-HEMA plates | Labline Instruments | Imperial III 305 | |
| Tabletop centrifuge | Heraeus | 75003429/01 | |
| 6 well glass-bottom dish | MatTek corp. | P06G-1.5-20-F | |
| Fibronectin | Sigma | F1141-1MG | |
| PBS | Cellgro | 21-040-CV | |
| Timelapse Microscope: | |||
| Microscope | Nikon | Ti-E Inverted Motorized Fluorescence time-lapse microscope with integrated Perfect Focus System | |
| Lens | Nikon | 20X-0.75 numerical apeture | |
| Halogen transilluminator | Nikon | 0.52 NA long working distance condenser | |
| Excitation and emission filters | Chroma single pass filters in Nikon housing | GFP Ex 480/40, Em 525/50 RFP-mCherry Ex 575/50 Em 640/50 | |
| Transmitted and Epifluoresce light path | Sutter | Smart Shutters | |
| Linear-encoded motorized stage | Nikon | ||
| Cooled charged-coupled device camera | Hamamatsu | ORCA-AG | |
| Microscope incubation chamber with temperature and CO2 control | custom-built | ||
| Vibration isolation table | TMC | ||
| NIS-Elements software | Nikon | Version 3 |
References
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