Imagem Multimodal de implante de células-tronco no sistema nervoso central de camundongos
Summary
Este artigo descreve uma sequência otimizada de eventos para imagiologia multimodal de enxertos celulares no cérebro de roedores por meio de: (i) na bioluminescência vivo e ressonância magnética, e (ii) a análise post mortem histológica. A combinação destas modalidades de imagem em um único animal permite uma avaliação do enxerto celular com alta resolução, sensibilidade e especificidade.
Abstract
Durante a última década, o transplante de células estaminais ganhou interesse crescente como primário ou secundário modalidade terapêutica para uma variedade de doenças, tanto em estudos pré-clínicos e clínicos. No entanto, até à data resultados referentes resultado funcional e / ou tecido regeneração transplante de células estaminais seguinte são bastante diversos. Geralmente, um benefício clínico é observado sem uma profunda compreensão do mecanismo subjacente (s) 1. Portanto, os esforços têm múltiplas levou ao desenvolvimento de diferentes modalidades de imagens moleculares para monitorar enxerto de células-tronco com o objectivo último para avaliar com precisão o destino, sobrevivência e fisiologia de células estaminais enxertados e / ou do seu ambiente de micro-. Alterações observadas em um ou mais parâmetros determinados por imagem molecular pode estar relacionado com o efeito observado clínica. Neste contexto, os nossos estudos focalizam o uso combinado de imagem de bioluminescência (BLI), ressonância magnética (MRI) e Analysi histológicas para avaliar células estaminais do miocárdio.
BLI é normalmente usado para executar de forma não invasiva de rastreamento de células e monitorar a sobrevivência das células no tempo após o transplante de 2-7, com base numa reacção bioquímica onde as células expressando o gene repórter da luciferase-são capazes de emitir luz interacção seguinte com o seu substrato (por exemplo, D- luciferina) 8, 9. RM, por outro lado é uma técnica não-invasivo que é clinicamente aplicável 10 e pode ser usado para localizar precisamente os enxertos celulares com resolução muito elevada 11-15, embora a sua sensibilidade altamente depende do contraste gerado após marcação das células com um agente de contraste para IRM . Finalmente, post-mortem análise histológica é o método de escolha para validar os resultados de pesquisa obtidos com técnicas não-invasivas com maior resolução e sensibilidade. Além disso end-point análise histológica nos permite realizar uma análise detalhada fenotípica das células enxertadas e / ou tecido circundante, based sobre a utilização de proteínas repórter fluorescentes e / ou rotulagem célula directa com anticorpos específicos.
Em resumo, estamos aqui visualmente demonstrar a complementaridade de BLI, ressonância magnética e histologia para desvendar células-tronco e diferente / ou meio ambiente associada seguintes características de células-tronco de enxerto no sistema nervoso central de camundongos. Como um exemplo, derivadas da medula óssea células estromais, geneticamente modificados para expressar o reforço de Proteína Fluorescente Verde (eGFP) e luciferase do pirilampo (FLUC), e marcadas com azul fluorescentes micron de tamanho de partículas de óxido de ferro (MPIOs), vai ser enxertados na SNC de camundongos imuno-competentes e os resultados serão monitorados por BLI, ressonância magnética e histologia (Figura 1).
Protocol
Discussion
Neste relatório, nós descrevemos um protocolo otimizado para a combinação de três modalidades de imagem complementares (BLI, ressonância magnética e histologia) para a caracterização detalhada dos implantes celulares no sistema nervoso central de camundongos imunes competentes. Uma combinação de rotulagem de gene repórter de células, com base na modificação genética com os genes repórter luciferase do pirilampo e EGFP, e uma célula de rotulagem directa com a GB MPIO, conduz a uma avaliação precisa de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| IMDM | Lonza | BE12-722F | Component of the cell growth medium CEM |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270-106 | Component of the cell growth medium CEM |
| Horse serum | Gibco | 1605-122 | Component of the cell growth medium CEM |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140 | Component of the cell growth medium CEM |
| Fungizone | Gibco | 15290-018 | Component of the cell growth medium CEM |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| Puromycine | Invivogen | ant-pr-1 | |
| trypsin | Gibco | 25300 | |
| GB MPIO | Bangs Laboratories | ME04F/7833 | |
| D-luciferin | Promega | E1601 | |
| Ketamine (Ketalar) | Pfizer | ||
| Xylazine (Rompun) | Bayer Health care | ||
| Isoflurane | Isoflo | 05260-05 | |
| 0.9% NaCl solution | Baxter | ||
| paraformaldehyde | Merck | 1.04005.1000 | |
| sucrose | Applichem | A1125 | |
| Micro-injection pump | KD scientific | KDS100 | |
| Photon imager | Biospace Lab | ||
| 9.4T MR scanner | Bruker Biospin | Biospec 94/20 USR | |
| BX51 microscope | Olympus | BX51 | |
| Mycrom HM cryostat | Prosan | HM525 | |
| syringe | Hamilton | 7635-01 | |
| 30 gauge needle | Hamilton | 7762-03 | |
| Photo Vision software | Biospace Lab | ||
| M3vision software | Biospace Lab | ||
| Paravision 5.1 software | Bruker Biospin | ||
| Amira 4.0 software | Visage Imaging |
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