הדמית פליטת אור של פעילות מונואמין NADPH במודלים של בעלי חיים שונים

Summary

מונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של מיני חמצן תגובתי (ROS) בphagocytes. בשל האופי הארעי של ROS, קשה למדוד ולעקוב אחר רמות ROS חי חיות. שיטה פולשנית לכימות סידורית של ROS בעכברים חיים מתוארת.

Abstract

מונואמין NADPH הוא אנזים שמתווך הגנה מארחת ואנטיבקטריאלי נגד פטריות. בנוסף לתפקידה בהגנה מארחת מיקרוביאלית, מונואמין NADPH יש פונקציות קריטיות איתות המווסתות את התגובה הדלקתית ^1. לכן, הפיתוח של שיטה למדידה ב" בזמן אמת "קינטיקה של דור ROS אוקסידאז המופק NADPH צפוי להיות כלי מחקר חשוב להבנת מנגנונים רלוונטיים לארח הגנה, דלקת, ופציעה.

מחלה כרונית granulomatous (CGD) היא הפרעה תורשתית של מונואמין NADPH מתאפיין זיהומים קשים ודלקות מוגזמות. הפעלה של מונואמין NADPH תא בלען דורשת טרנסלוקציה של יחידות המשנה שלה cytosolic (p47 ^phox, P67 ^phox, וp40 ^phox) וRAC לflavocytochrome קרום נכנס (מורכב מgp91 ^phox וp22 ^phox heterodimer). פסדפונקציה של מוטציות בכל אחד מאלה תוצאת רכיבי מונואמין NADPH בCGD. בדומה לחולים עם CGD, gp91 עכברים ^phox-p47 לקויים ועכברים ^{phox-חסרים} לי פגום פעילות תא בלען NADPH אוקסידאז ומארח לקוי הגנה ^{13, 14.} בנוסף לphagocytes, המכיל את רכיבי מונואמין NADPH שתוארו לעיל, מגוון של סוגי תאים אחרים להביע isoforms השונה של מונואמין NADPH.

כאן, אנו מתארים שיטה לכמת ייצור ROS בעכברים חיים ולהתוות את התרומה של מונואמין NADPH לדור ROS במודלים של דלקת ופגיעה. שיטה זו מבוססת על ROS מגיב עם L-012 (אנלוגי של לומינול) לפלוט הארה שנרשמה על ידי מכשיר תשלום מצמיד (CCD). בתיאור המקורי של חללית L-012, L-012 chemiluminescence תלוי בוטל לחלוטין על ידי dismutase superoxide, המציין כי ROS העיקרי זוהה בתגובה זה היה סופראניון תחמוצת ^15. מחקרים מאוחרים יותר הראו כי L-012 יכולים לזהות רדיקלים חופשיים אחרים, כולל מינים תגובתי חנקן ^{16, 17.} Kielland et al. ¹⁷ הראה כי יישום המקומי של יצטט phorbol myristate, activator החזק של מונואמין NADPH, הוביל לדור מונואמין NADPH התלוי ROS שניתן היה לזהות בעכברים באמצעות חללית זורח L-012. במודל זה, הם הראו כי הארת L-012-תלויה בוטלה בעכברי p47 ^{phox-לקויים.}

אנחנו לעומת דור ROS בעכברי wildtype וNADPH אוקסידאז-p47 לקוי ^{phox-/ –} עכברים ² בשלושת הדגמים הבאים: 1) ממשל intratracheal של zymosan, תא פרו דלקתי פטרייתי המופק מקיר מוצר שיכול להפעיל מונואמין NADPH: 2) קשירת cecal ולנקב (CLP), מודל של אלח דם תוך בטנים עם דלקת ריאות חריפות משניות ופציעה; ו3) פחמן טטראכלורי האוראלי(CCl _4), מודל של פגיעה כבדית ROS תלויה. מודלים אלה נבחרו במיוחד כדי לבדוק את דור ROS מונואמין NADPH תלוי בהקשר של דלקת שאינה זיהומית, אלח דם polymicrobial, ופציעת איבר רעל מושרה, בהתאמה. השוואת פליטת אור בעכברי wildtype לp47 ^{phox-/ –} עכברים מאפשר לנו להתוות את התרומה הספציפית של ROS שנוצרה על ידי p47 מונואמין NADPH ^phox המכיל לאות bioluminescent בדגמים אלה.

תוצאות הדמית פליטת אור שהפגינו רמות גבוהות ROS בעכברי wildtype לעומת p47 ^{phox-/ –} עכברים הצביעו על כך שמונואמין NADPH הוא המקור העיקרי של דור ROS בתגובה לגירויים דלקתיים. שיטה זו מספקת גישה זעירה פולשנית לניטור "בזמן אמת" של דור ROS במהלך הדלקת בגוף חי.

Protocol

1. מודלים של בעלי חיים עכברים: השתמשו p47 phox-/ – עכברים ועכברי גיל ומין בהתאמת C57BL6/DBA. לקבל אישור לניסויים מטיפול בבעלי חיים מוסדיים ועדה ושימוש. הרדמה: השתמש במערכת ממשל isoflurane מתמשכת ?…

Discussion

מדידה "בזמן אמת" של מיני חמצן תגובתי (ROS) בבעלי חי חיים יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בבדיקות ניאון וchemiluminescent. בעוד בדיקות ניאון סובלות מצורך יחסי אות לרעש חלשים ^12, טכניקת ההדמיה תארה היא רגישה יותר לזיהוי של פליטת אור בעקבות תגובה כימית של ROS עם מצע לומינול …

Materials

Name of the reagent	Company	Catalog number	Comments
L-012	Wako Chemicals USA, Inc.	120-04891
Zymosan	Sigma, St. Louis, MO	Z4250
carbon tetrachloride	Sigma, St. Louis, MO	289116