ويرد تبسيط العمل لدراسة الحامض النووي والتغيرات في التعبير الجيني في وقت مبكر على الحياة التوتر. بدءا من فصل الأمهات من الفئران حديثي الولادة والعزلة من أنسجة المخ المنفصلة، التي نمثلها بروتوكول لعزل في وقت واحد DNA و RNA من اللكمات أنسجة المخ لتسلسل بيسلفيت اللاحقة وتحليل RT-PCR.
التعرض لاتباع نظام غذائي، يمكن أن المخدرات والمحن في وقت مبكر الحياة خلال النوافذ الحساسة من حياة 1،2 تؤدي إلى تغييرات دائمة في التعبير الجيني التي تسهم في العرض من الظواهر الفسيولوجية والسلوكية. البرمجة البيئية مثل من المرجح أن تزيد من التعرض للأمراض، الأيض القلب والأوعية الدموية والعقلية 3،4.
ويعتبر الحامض النووي وتعديلات بسيطة العمليات الرئيسية في وساطة للحوار الجينات والبيئة، ويبدو أيضا أن الأساس الذي تقوم عليه البرمجة البيئية 5. في الثدييات، والحامض النووي وعادة ما تضم إضافة التساهمية لمجموعة الميثيل في موقف-5 من السيتوزين في سياق dinucleotides الدليل السياسي الشامل.
مثلأيشن الدليل السياسي الشامل يحدث بطريقة الأنسجة والخلايا محددة للغاية مما يجعلها تمثل تحديا لدراسة منفصلة، ومناطق صغيرة من المخ حيث التجانس الخلوية عالية وكمية محدودة الأنسجة. وعلاوة على ذلك، بترتبط ارتباطا وثيقا ecause التعبير الجيني ومثيلة أحداث، يمكن المكتسبة ارتفعت قيمة وبمقارنة كل من المعلمات في نفس العينة.
هنا، ويرد على بروتوكول خطوة بخطوة (الشكل 1) للتحقيق في برمجة جينية في الدماغ باستخدام نموذج على "فصل الأمهات" المحن الحياة في وقت مبكر لأغراض التوضيح. بروتوكول يصف إعداد micropunches من أدمغة فئران تفاضلي في سن من الذي يمكن أن الحمض النووي والحمض النووي الريبي معزولة في وقت واحد، مما يسمح لتحليل الحامض النووي والجينات في نفس العينة.
ويتزايد الاعتراف برمجة جينية باعتباره آلية هامة الكامنة وراء الصحة والمرض. هنا نقدم اتباع أسلوب دقيق للعزلة في وقت واحد من الحمض النووي والحمض النووي الريبي من micropunches والخطوات اللاحقة للحصول على ملامح الحامض النووي من خلال التسلسل بيسلفيت. سير العمل الأمثل يسمح تحليل ملائم للبرمجة جينية في الدماغ استجابة للمؤثرات البيئية. وعلاوة على ذلك، ويسهل هذا النهج من التحقيق في العلاقة الوظيفية بين الحامض النووي والجينات كما يتم تحليل كل من نفس العينة. أخيرا، يمكن أن أعداد الحيوانات اللازمة للتجربة انخفاضا كبيرا.
وينبغي الأخذ ببعض الاحتياطات والمبادئ التوجيهية أثناء تنفيذ العمل المقدمة. نظرا لتعقيد غير عادية وعدم التجانس في الدماغ ومنذ مثيلة والتعبير نمط قد تختلف بطريقة الخلايا والأنسجة معين هو من أقصىيتم تنفيذ أهمية أن micropunching بطريقة موحدة. كما مثال على ذلك، تم الكشف عن برمجة جينية من AVP في paravaventriuclar، ولكن ليس في النواة فوق البصرية (الشكل 4B-D)، واثنين من AVP معربا عن مناطق ما تحت المهاد 4. في هذا الصدد، وتوافر DNA و RNA من لكمة النسيج نفسه هو مفيد والتعبير RNA من الجينات الأنسجة علامة معينة يمكن استخدامها في بعض الحالات للتصديق على أن تعرض للكم المكان الصحيح. على الرغم من أن micropunching يمكن أن تقلل من عدم التجانس الخلوية، وأنه لا بد من التذكير بأن هذا النهج لا يؤدي إلى عزل أنواع خلية واحدة أو السكان. يمكن أن تعتبر خطوات تنقية إضافية لمعالجة هذا الموضوع.
لبيسلفيت التسلسل الأمثل التصميم التمهيدي لتلقي العلاج PCR التضخيم بيسلفيت التالية أمر ضروري. المنتجات يمكن ان PCR يتجاوز 400 شركة بريتيش بتروليوم في طول أن يكون مشكلة بسبب تدهور الحمض النووي من قبل بisulfite العلاج. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن PCR المتداخلة يمكن أن تعطي نتائج منحازة إلا إذا كان بعض القوالب سليمة تسهم في عملية التضخيم. وينبغي تصميم أزواج التمهيدي التي هي محددة لamplicon المحورة؛ متواليات لا ينبغي أن تحتوي على dinucleotides الدليل السياسي الشامل من أجل تجنب مثيلة المنحازة التضخيم. وبالإضافة إلى ذلك، يجب أن تحتوي على الاشعال عدم الدليل السياسي الشامل cytosines لمنع تضخيم الحمض النووي معدلة أو تحويلها بشكل غير كامل. قد التضخيم من بعض القوالب الاستفادة من إجراء الساخن بداية PCR. على أي حال، ينبغي التحقق من ملاءمة من أزواج التمهيدي في التجارب الرائدة وذلك لمنع تلف العينات التجريبية قيمة.
تسلسل بيسلفيت يمثل طريقة قياسية لتحليل مثيلة في مواقع محددة كما أنها قادرة على موثوق بها وعلى وجه التحديد الكشف عن مثيلة من مخلفات الدليل السياسي الشامل واحدة بطريقة أليل محددة 8. لا ينصح التسلسل المباشر للمنتج PCR كما س مثيلة مختلطواتحاد كرة القدم الدليل السياسي الشامل بقايا تبدو وكأنها ذروة C / T مزدوجة في مخطط رحلاني، التي يمكن أن تمنع الكمي لمثيلة في الموقع المعني. لهذا السبب يجري استنساخ خطوة وسيطة والتسلسل استنساخ عدة (~ 20-30) لتحديد مدى مثيلة. Pyrosequencing يمثل طريقة بديلة لتحديد الحامض النووي. فإنه يستخدم أيضا تحويل بيسلفيت وبيسلفيت PCR ولكن بدلا من استنساخ وتسلسل يتعرض amplicon الى رد فعل pyrosequencing مباشرة حيث يتم قراءة حالة مثيلة من بقايا الدليل السياسي الشامل باعتباره تعدد الأشكال C / تي للتركيبات النووية المنفردة التي يمكن قياسها كميا بسهولة. كلا أساليب الكشف عن مستويات مماثلة من مثيلة 9 ولكن نظرا لأنه يمكن حذف استنساخ خطوة pyrosequencing هو مزيد من الوقت بكفاءة. ومع ذلك، يمكن اعتمادا على قالب تكون متسلسلة فقط 40-100 النيوكليوتيدات في آن واحد بحيث عدة جولات من pyrosequencing التمهيدي مع تسلسل مختلفة ضرورية. هذا هو الحد الحرج، نظرا ثاهناك حاجة إلى كميات أعلى طن من الحمض النووي (حوالي 1 ميكروغرام لكل رد فعل)، وهو المنظور تتجاوز المبالغ المتاحة من اللكمات صغيرة أنسجة المخ. وهكذا المسح الأولي لمناطق واسعة من kilobases عدة pyrosequencing يبدو أقل ملاءمة مثل القراءة استنساخ واحدة. ومع ذلك، ينبغي النظر بعد في التعرف على منطقة صغيرة من pyrosequencing الفائدة.
بشكل جماعي، والبروتوكول المذكورة أعلاه توفر نهجا دقيقة وفعالة ومبسطة لتحليل سريع وفعال من حيث التكلفة من micropunches الدماغ لإحداث تغييرات جينية. يمكن معالجة عينات متعددة في تشغيل واحد، والأساليب المناسبة عند تشغيل عينات من التجارب المتوسطة الحجم.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل معهد ماكس بلانك للطب النفسي والاتحاد الأوروبي وماري كوري شبكة التكوين الأولي (نينا عقد 238665).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69506 |
Nucleospin RNA II | Macherey-Nagel | 740955.50 |
Epitect Bisulfite Kit | Qiagen | 59104 |
Nucleospin Extract | Macherey-Nagel | 740609.50 |
pGEM-T Vector Cloning Kit | Promega | A3600 |
Nucleofast 96 | Macherey-Nagel | 743100.50 |
Montage 96 Sequencing Clean-Up | Millipore | LSK09624 |
Hotstar Taq Polymerase | Qiagen | 203203 |
Taq Polymerase | Fermentas | EP0401 |